Nagu üks õpilane bioloogilise keemia eksamil ütles: "ensüüm on siis, kui midagi on väga vähe, kuid see võib mäge keerata." Üliõpilast sellise määratluse eest ei kiitnud, kuid ta tabas asjade olemuse õigesti - ensüümid kiirendavad kordades ainetevahelist reaktsiooni, mis ilma nendeta kas üldse ei toimu või toimub kordades aeglasemalt.
Esimene bakterite rakuseintele lüütilise toimega ensüüm oli lüsosüüm, mille avastas 1922. aastal kuulus inglise mikrobioloog Alexander Fleming, kes avastas esmakordselt lüsosüümi paljudes loomorganismide kudedes ja sekretsioonides ning pakkus välja, et see on kaitseaine, mis võimaldab kõrgemat organismid, et võidelda nende elupaigas patogeensete bakterite vastu. Huvitav on märkida, et see Flemingi avastus tehti peaaegu 10 aastat varem kui tema teine, kuulsam teadussaavutus - penitsilliini struktuuri avastamine ja dekodeerimine (koos H. W. Flory ja E. B. Chainiga), mis on esimene ja enim kasutatud penitsilliini. antibiootikum hiljem. Esimesed teated, et bakteritel on ka võime toota bakteriolüütilisi ensüüme, hakkasid ilmuma juba 1950. aastate alguses. Praeguseks on neid leitud kõigist uuritud bakteritest.
Sel juhul võib ensüüm interakteeruvate ainete hulgaga võrreldes olla tühine - miljoneid kordi väiksem. Ja mis on eriti huvitav, ensüümi kogus ei vähene: üks selle molekulidest võib reaktsiooni mitu korda teenida ja olla uuesti töövalmis (nii jahvatab hea veski ikka ja jälle uusi teri ilma veskikivide märgatava kulumiseta) .
See tähendab, et need eriühendid kuuluvad katalüsaatorite – keemiliste reaktsioonide kiirendajate hulka. Selliseid katalüsaatoreid tuntakse ka elutus looduses, nii et neid, mis on ainult elusolenditel, nimetatakse biokatalüsaatoriteks. Need on koostiselt valgud. Iga reaktsioon vajab oma ensüümi: see sobib sellega nagu luku võti. Seetõttu on taimedes, loomades ja mikroobides väga palju selliseid katalüütilisi valke.
Seni pole aga reaktsiooni toimumise mehhanismi veel täielikult uuritud. Mõned teadlased usuvad, et suured ensüümi molekulid on reaktsioonis osalevate ainete molekulide kohtumispaik. On ka teisi oletusi. Me ei analüüsi neid, vaid teeme üldise järelduse: iga organismi eluks on vaja palju ensüüme ja nende komplektist, sealhulgas mikroorganismi toitumisviisist.
Neid mikroobe, mille toitmiseks on vaja ainult anorgaanilisi ühendeid - hapnikku, teatud soolade lahuseid, väävlit - nimetatakse autotroofideks (vene keelde tõlgituna tähendab see nimi: need, kes toituvad ise).
Autotroofid ehitavad oma valgud ja nukleiinhapped, võib öelda, mitte millestki – lämmastikuühenditest, veest, hapnikust... See on nagu Cheopsi püramiidi ehitamine pisikestest tellistest (ja mitte mitmetonnistest kiviplokkidest, millest see tegelikult koosneb). koostatud). Võite isegi välja arvutada, mitu korda on kogu "püramiid" (ütleme, tohutu desoksüribonukleiinhappe molekul - ja kui pikk nimi!) on rohkem kui üks "telliskivi" - süsinikdioksiidi või ammoniaagi molekul.
Desoksüribonukleiinhappe (mida nimetatakse lühidalt DNA-ks) molekulmass bakterites on 1000 miljonit; süsihappegaasi molekulmass on 44. See tähendab, et kogu “hoone” on 20 miljonit korda suurem kui “tellistest” (võib meenutada, et praegu kulub korruselamule umbes 100 tuhat tellist). Ja kogu molekulaarstruktuur "püstitatakse" umbes poole tunniga (aeg, mis kulub bakterirakule omalaadse tootmiseks).
Kui rääkida bakteriolüütiliste ensüümide paiknemisest bakterikultuuris, siis tuleks need selles osas ennekõike kolme rühma jagada.
Esimene rühm koosneb autolüsiinidest - bakteriolüütilistest ensüümidest, mis on alati olemas (aktiivses või mitteaktiivses olekus) rakuseinas endas. Nad osalevad bakterirakkude kasvu ja diferentseerumise protsessis. Ilmselt on bakterirakus normis seos rakuseina komponente hävitavate ja sünteesivate ensüümide aktiivsuse vahel. Tõepoolest, äsja sünteesitud materjalide inkorporeerimine rakuseina ei saa toimuda ilma teatud keemiliste sidemete eelneva lõhustamiseta.
Seina lüüsi ja biosünteesi protsessid toimuvad samaaegselt bakteriraku kasvu ja arenguga ning alles hilisemates arengufaasides, kui biosünteesiprotsessid raugevad ja lüütiliste ensüümide aktiivsus jääb samaks, toimub bakteriraku lüüs.
Teise rühma kuuluvad bakterieoste lüütilised ensüümid. Need aktiveeruvad koos teiste ensüümidega, mis osalevad biopolümeeride lagundamisel eoste tekke (eoste moodustumise) perioodil ja bakterite eoste idanemise ajal. Need ensüümid osalevad bakteriraku kesta hävitamise protsessides ja autolüsiinidena bakteriraku kasvu- ja morfogeneesiprotsessides.
Lõpuks, kolmas rühm on ekstratsellulaarsed lüütilised ensüümid. Nende bioloogiline roll näib seisnevat selles, et selliseid ensüüme sünteesivatel ja keskkonda sekreteerivatel bakteritel on teiste bakterite ees eelis, eelkõige toiduallikates. Teiste bakterite rakke hävitades kasutab lüütilisi ensüüme tootv bakter oma vajadusteks aminohappeid, süsivesikuid ja muid lüüsitud raku komponente. Lisaks on sellel bakteriolüütiliste ensüümide rühmal kindlasti oluline roll neid ensüüme keskkonda eritavate rakkude kaitsmisel teiste samas ökoloogilises nišis elavate bakterite eest.
Töö tutvustus
Probleemi seis ja probleemi kiireloomulisus
Bakteriraku seinu hävitavad lüütilised ensüümid* avastati esmakordselt inimese süljes ja neid kirjeldas Alexander Fleming 1922. aastal (Fleming, 1922). Aine sai nimeks lüsosüüm, mis tähendab "ensüümi, mis lahustab baktereid". 1929. aastal kirjeldas Fleming esimest korda seene antibakteriaalseid omadusi. Penicillum notatum - esimese tööstusliku antibiootikumi penitsilliini tootja, mille eest pälvis ta 1945. aastal koostöös Ernest Cheyne'i ja Howard Floryga Nobeli preemia. Pärast penitsilliini vabanemist ja siiani on tehtud pidevat tööd uute antibiootikumide loomisel ja tootmisel, mis on tingitud mitte ainult vajadusest saada vajaliku spetsiifilisuse ja parema kvaliteediga aineid, vaid ka patogeensete mikroobide pidevast esilekerkimisest. mis on resistentsed mis tahes, isegi uusima antibiootikumi (). Sellest tulenev ebasoodne olukord nakkushaiguste ravis sunnib otsima uusi tõhusaid antimikroobseid aineid. Paljud teadlased viitavad lüütiliste ensüümide sel eesmärgil kasutamise väljavaadetele, kuna nende toimimine mikroobidele, nimelt mikroobiraku lahustumine, võimaldab loota, et neile resistentseid patogeene ei ilmu.
* Mõiste "lüütilised ensüümid" tähistab nüüd hüdrolaase, mis hävitavad erinevate mikroorganismide rakuseinte struktuurseid polümeere. Sõltuvalt sellest, milliseid mikroorganisme nad hävitavad, jagunevad lüütilised ensüümid bakteriolüütilisteks, pärmi- ja mükolüütilisteks. Substraadi spetsiifilisuse järgi võib need jagada kitinaasideks, proteaasideks, peptidoglükaanhüdrolaasideks ja glükanaasideks. See sõltub sellest, millised polümeerid, mis on osa erinevate mikroorganismide rakumembraanidest, hävitavad lüütilisi ensüüme. Omakorda näiteks peptidoglükaani hüdrolaasid, mis hävitavad bakteriraku seinte struktuurikomponendi peptidoglükaani, sõltuvalt sellest, millist sidet peptidoglükaani molekulis hüdrolüüsivad, jagunevad glükosidaasideks (N-atsetüülglükoosaminidaasid ja N-atsetüülmuramidaasid (lüsosüümid)), amidaasideks ja endopeptidaasid. Erilist tähelepanu väärivad bakteriolüütilised proteaasid. Praegu teadaolevate bakteriolüütiliste proteaaside hulgas on neid väga vähe. Kuid just nendel lüütilise rühma ensüümidel on kõige laiem toimespekter mikroorganismide vastu. Nad on võimelised hävitama bakterite, pärmseente, niitjate seente ja algloomade rakumembraane.
Olenevalt kontekstist kasutatakse selles töös mõisteid "lüütilised ensüümid", "bakteriolüütilised ensüümid", "peptidoglükaani hüdrolaasid", "pärmi ensüümid", "lüütilised proteaasid".
Ajavahemikul 5. kuni 20. sajandi 70. aastateni tehti intensiivne töö selliste ensüümide tootjate leidmiseks, isoleerimiseks ja omaduste uurimiseks. Nüüdseks on teada, et paljud elusorganismid – viirustest inimesteni – toodavad lüütilisi ensüüme. Bakterite hulgas leiti ensüümitootjaid, kes lüüsivad aktiivselt mitte ainult konkureerivate bakterite rakke, vaid ka teiste süstemaatiliste rühmade mikroorganismide rakke - pärm, niitseened ja algloomad. Selliste bakterite jaoks moodustati tellimus 1978. aastal Lüsobakterid, sealhulgas perekond Lysobacteraceae ja perekond Lüsobakter kombineerides nelja liiki (Christensen ja Cook, 1978). Sellesse süstemaatilisse rühma kanti üle bakterid, mis varem kuulusid teistesse perekondadesse, kuid erinesid oma tüüpilistest esindajatest mitmete omaduste poolest ja mis kõige tähtsam - poliitilise võimekuse poolest. Hiljem huvi lüüsivate bakterite vastu mõnevõrra nõrgenes, kuid nüüd on need taas teadlastele huvi pakkunud. 21. sajandi esimesel kümnendil üksteist uut liiki perekonnast Lüsobakter. Teadaolevate mikroorganismide süstematiseerimisel käimasoleva töö tulemusena korrigeeriti ka perekonna süstemaatilist asendit. Lüsobakter. Nüüd on see perekonnas kaasatud Xanthomonadaceae(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001.) Kirjanduses võib siiski täheldada ilmset segadust kirjeldatud lüütiliste ensüümide tootjate süstemaatilises positsioonis. Näiteks ensüümide tootja, mis on kõigi omaduste poolest sarnased seda tüüpi ensüümidega. perekonna liigid Lysobacter – Lysobacter enzymogenes – mida autorid nimetavad Achromobacter lyticus(Shiraki ja ah, 2002, Elu või/., 1997).
Bakterite puhul, mis toodavad rakuväliseid lüütilisi ensüüme, nagu ka
Mis tahes bakterite puhul on elutähtsad rakusisesed autolüütilised ensüümid, mis hävitavad kovalentseid sidemeid nende rakuseina peamises struktuurikomponendis peptidoglükaanis ning mängivad seega suurt rolli kasvu- ja jagunemisprotsessides. Ekstratsellulaarseid lüütilisi ensüüme tootvate bakterite rakkudes toimub paralleelne süntees ja liikumine läbi tsütoplasmaatilise membraani nende toimekohta nii autolüütiliste ensüümide, mis võivad paikneda membraanis, periplasmas ja rakuseinas, kui ka erituvate ekstratsellulaarsete bakteriolüütiliste ensüümide puhul. keskkonda. Sellega seoses on loogiline küsida nende ensüümide samaaegse toimimise protsessi mehhanismi ja regulatsiooni kohta, kas autolüütilised ensüümid võivad olla rakuväliste bakteriolüütiliste ensüümide eelkäijad? Praeguseks on avaldatud suur hulk töid bakterite nii ekstratsellulaarsete kui ka intratsellulaarsete bakteriolüütiliste ensüümide eraldamise ja iseloomustamise kohta. Seni aga
Seni puuduvad andmed sama bakteri rakuväliste ja intratsellulaarsete lüütiliste süsteemide võrdleva uuringu kohta. Autolüütilisi ensüüme on hästi uuritud paljudel grampositiivsete bakterite esindajatel (Shockman ja Holtje, 1994), gramnegatiivsetel, välja arvatud Escherichia coli(Holtje ja Tuomanen, 1991), pole neid täpsemalt uuritud.
1973. aastal alustati NSVL Teaduste Akadeemia IBFM-is (IBPM RAS) Teaduste Akadeemia korraldusel tööd teemal “Tõhusate vahendite loomine antibiootikumiresistentsete patogeensete mikroorganismide vastu võitlemiseks”. Moskva oblastis Pushchino reoveepuhasti piirkonnas 1976. aastal Oka jõe veest eraldatud gramnegatiivse bakteri kultuurivedelik oli lüsoamidaasi nimelise bakteriolüütilise ja proteolüütilise toimega preparaadi aluseks. Lüsoamidaasi edukad kliinilised uuringud võimaldasid registreerida selle ravimina grampositiivse mikrofloora põhjustatud väliste infektsioonide raviks. Vastavalt mitmetele morfoloogilistele ja biokeemilistele tunnustele omistati tootev bakter oletatavasti perekonda Xanthomonas. Kuid mitmete oluliste omaduste, näiteks liikuvuse puudumise tõttu erines lüsoamidaasi tootja selle perekonna bakteritest.
Töö eesmärk ja ülesanded
Töö eesmärgiks on uurida lüsoamidaasiravimi bakterit tootva rakusisese ja rakuvälise lüütilise süsteemi funktsioneerimise biokeemilisi ja geneetilisi iseärasusi ning seoseid, et luua saadud info põhjal uue põlvkonna antimikroobsed ravimid. .
Peamised ülesanded:
bakteritootja taksonoomilise asukoha selgitamine;
bakteritootja peptidoglükaani - autolüütiliste ensüümide substraadi - struktuuri määramine;
produtseeriva bakteri ekstratsellulaarsete lüütiliste ensüümide eraldamine ja iseloomustamine;
tootja rakusiseste (autolüütiliste) ensüümide eraldamine ja iseloomustamine;
rakuväliste lüütiliste ensüümide geenide struktuuri määramine
tootja;
lüütiliste ensüümide interaktsiooni tunnuste uurimine
mitmesugused siht mikroorganismid;
tootja rekombinantsete lüütiliste ensüümide tootmine ja uuring
nende omadused hindamaks võimalust kasutada selliseid ensüüme nagu
uute antimikroobikumide põhialused;
lüsoamidaasi ja tootja lüütiliste ensüümide erinevate vormide kasutamise võimaluse uurimine "sisemiste" infektsioonide raviks siberi katku näitel.
Töö teaduslik uudsus
Väljakujunenud morfoloogiliste, biokeemiliste ja geneetiliste omaduste põhjal on antimikroobset ravimit lüsoamidaasi produtseeriv bakter määratud perekonda Lüsobakter. Selles töös uuritud tüvi Lüsobakter sp. XL1 saadi algsest kultuurist selektsiooni teel ja deponeeriti Ülevenemaalisesse mikroorganismide kollektsiooni (VKM V-2249D). On kindlaks tehtud, et selle lüütiliselt väga aktiivse tüve pikaajalisel kultiveerimisel rakuväliste saaduste sekretsiooni soodustavatel söötmetel tekivad lüütiliselt väheaktiivse tüve rakud, mis akumuleeruvad populatsioonis tänu suuremale kasvukiirusele. Lüsobakter sp. XL2.
Sama bakteri endotsellulaarset ja eksotsellulaarset lüütilist süsteemi iseloomustati esimest korda näite abil Lüsobakter sp. XL1 ja XL2. Mõlema tüve endotsellulaarne süsteem sisaldas üheksat erineva substraadi spetsiifilisuse ja lokalisatsiooniga ensüümi (glükosidaasid, amidaasid, endopeptidaasid). Osana ekstratsellulaarsest lüütilisest süsteemist Lüsobakter sp. XL1 leidis viis ensüümi, sealhulgas muramidaasi (LZ), amidaasi (L2), kolme endopeptidaasi (L1, L4, L5). Madala aktiivsusega tüve ekstratsellulaarne lüütiline süsteem Lüsobakter sp. XL2 koosneb muramidaasist ja amidaasist. Erinevate lüütiliste süsteemide ensüümide omadused erinevad üksteisest oluliselt: intratsellulaarsed ensüümid on happelised valgud, mis on aktiivsed temperatuuril 29C – optimaalse bakterite kasvu temperatuur, söötme kõrge ioontugevus ja aluseline pH; rakuvälised ensüümid on leeliselised valgud, mis on aktiivsed madala ioontugevuse, aluselise pH ja kõrge temperatuuri (50-80C) juures.
Esimest korda selgus, et kõrge molekulmassiga happelise polüsahhariidi ja ensüümide sekretsioonijärgne elektrostaatiline interaktsioon Lüsobakter sp. XL1 ei põhjusta mitte ainult ensüümide olulist stabiliseerumist, vaid mõnel juhul ka nende aktiivsuse muutust. Polüsahhariid suurendab muramidaasi toimet Staphylococcus aureus'e rakkudele ja polüsahhariidiga seotud lüütilised ensüümid on võimelised hävitama selle perekonna bakterite eoseid. batsill. Polüsahhariid Lüsobakter sp. XL1 pärsib täielikult paljude teiste tootjate lüütiliste ensüümide aktiivsust. Ilmselgelt on selliste ekstratsellulaarsete komplekside moodustumine mikroorganismide poolt nende jaoks ökoloogiliselt oluline.
Esimest korda näidati, et ekstratsellulaarsed lüütilised ensüümid L2 ja L5 Lüsobakter sp. siseneda rakku ümbritsevasse ruumi välismembraani vesiikulite sees, mille moodustab bakter. Vesiikulitesse suletud ensüümid on võimelised lüüsima erinevate mikroorganismide rühmade esindajate elusrakke, näiteks perekondadesse kuuluvate gramnegatiivsete bakterite Pseudomonas, Proteus, Erwinia, Alcaligenes, Perekonda kuuluvad grampositiivsed bakterid Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Rothayibacter, pärm perekonnast Candida niitjas seen Sclerotinia sclerotiorum, erinevalt lüütilistest ensüümidest väljaspool vesiikuleid. Seega on selline lüütiliste ensüümide sekretsioonirada produtseeriva raku jaoks suure bioloogilise tähtsusega, kuna see laiendab mikroorganismide spektrit, millega ta võib looduses konkureerida.
On kindlaks tehtud ekstratsellulaarsete lüütiliste ensüümide koostoime olulised tunnused Lüsobakter sp. natiivsete sihtrakkudega. Gram-positiivsete bakterirakkude tõhusaks hüdrolüüsiks vajavad ensüümid eelnevat kokkupuudet negatiivselt laetud rakuseina polümeeriga (teihoiin- või teikhuroonhapped), samas kui polümeeri keemiline struktuur ei ole kriitiline. Gramnegatiivsete bakterite natiivsed rakud lüütilised ensüümid Lüsobakter sp (3a, välja arvatud L5) hävib ainult juhul, kui sihtraku välismembraan on eelnevalt sobiva meetodiga destabiliseeritud (temperatuur, polümüksiin B, gentamütsiin, amikatsiin). Lüütiline ensüüm L5 hävitab gramnegatiivsete bakterite rakud ilma eelneva töötlemiseta.
Töö praktiline tähendus
Saadud andmete põhjal töötati välja uus protseduur lüsoamidaasi preparaadi saamiseks suure sihtprodukti saagisega (kuni 80%) ja seda suurendati.
On välja töötatud meetodid kahe rekombinantse lüütilise endopeptidaasi saamiseks Lüsobakter sp. XLl kasutades heteroloogseid süsteeme, mis põhinevad E. coli(inklusioonkehadest ümbervoltimine) ja Pseudomonas fluorescens(eritunud valkude puhastamine).
Võimalus kasutada ravimit lüsoamidaasi, samuti vesiikuleid Lüsobakter sp. XLl eksperimentaalse siberi katku erinevate vormide raviks.
Lõputöö materjalide põhjal saadi Vene Föderatsiooni patendid: nr 2139348 (1999), nr 2193063 (2002), nr 2296576 (2007), nr 2407782 (2010), nr 24081725, USA (2010). patent nr 7 150 985 B2 (2006), Hiina patent nr 274608 (2006), Euroopa patent nr 1902719 B1 (2011).
Töös saadud uusi andmeid kasutatakse M. V. nimelise Moskva Riikliku Ülikooli bioloogiateaduskonna biokeemia kursustel. Lomonosovi ja teiste kõrgkoolide bioloogilised teaduskonnad.
Töö aprobeerimine
Lõputöö materjalid esitati kolmandal ja neljandal üleliidulisel konverentsil "Ensüümide biosüntees mikroorganismide poolt", Kobuleti, 1986; Taškent, 1988; Teine üleliiduline konverents "Haavad ja haavainfektsioon", Moskva, 1986; 14 Rahvusvaheline biokeemiakongress, Praha, CSSR, 1988; Üleliiduline konverents "Mikroobse ainevahetuse reguleerimine", Pushchino, 1989; Viies rahvusvaheline aktiivsete looduslike ühendite keemia ja biotehnoloogia konverents, Varna, Bulgaaria, 1989; 1 Rahvusvaheline sümpoosion "Bioloogiliste struktuuride molekulaarne korraldus", Moskva, 1989; 5 Euroopa biotehnoloogia kongress, Kopenhaagen, 1990; rahvusvaheline konverents nonantibiootikumide antimikroobse toime kohta, Kopenhaagen, 1990; Konverents “Mikroobsete polümeeride biosüntees ja lagunemine. Fundamentaalsed ja rakenduslikud aspektid”, Pushchino, 1995; Rahvusvaheline konverents "Mikroobne polüsahhariid", Kanada, 1995; Esimene rahvusvaheline konverents "Polysaccharide Engineering" Trondheim, Norra, 1995; Kirurgide konverentsid, Kaluga, 1996; IV sümpoosion "Proteolüütiliste ensüümide keemia", Moskva, 1997; Venemaa Teaduste Akadeemia Biokeemia Seltsi teine kongress, Moskva, 1997;
uuenduslike teadus-tehniliste projektide seminar-ettekanne
"Moskva piirkonna biotehnoloogiad-97", Pushchino, 1997; Rahvusvaheline sümpoosion "Mikroobse biokeemia ja biotehnoloogia kaasaegsed probleemid", Pushchino, 2000; rahvusvaheline konverents "Biotehnoloogia kahe aastatuhande vahetusel", Saransk, 2001; 3 Biokeemiaühingu kongress, Peterburi, 2002; Ülevenemaaline konverents “Meditsiinilise ensümoloogia probleemid. Uue sajandi laboridiagnostika kaasaegsed tehnoloogiad”, Moskva, 2002; Teine, viies, kuues Moskva rahvusvaheline kongress "Biotehnoloogia: seisund ja arenguväljavaated", Moskva, 2003, 2009, 2011; Esimene ülevenemaaline kongress "Meditsiinilise mükoloogia edusammud", Moskva, 2003; III konverents "Biotehnoloogia: uurimise seis ja perspektiiv", Moskva, 2005; Kolmas ülevenemaaline koolikonverents "Süsivesikute keemia ja biokeemia", Saratov, 2004; Konverentsid "Fundamentaalteadused-meditsiin", Moskva, 2005; konverents "Fundamentaal- ja rakendusuuringute tulemused uute ravimite loomiseks", Moskva, 2008; Ülevenemaaline konverents "Ökotoksikoloogia-2010", Tula, 2010; Konverents "Meditsiini alusteadused", Moskva, 2010, Ülevenemaaline rahvusvahelise osalusega sümpoosion "Mikroorganismide bioloogiliselt aktiivsed ained: minevik, olevik, tulevik", Moskva, 2011.
Väljaanded
Töö struktuur ja ulatus
Föderaalne Haridusagentuur
Riiklik õppeasutus
erialane kõrgharidus
Permi Riiklik Tehnikaülikool
Keemia ja biotehnoloogia osakond
Abstraktne:
lüütilised ensüümid. Lüsosüüm
Esitatud:
õpilane gr.KhTBmPiB-05
Ševtšenko I.K.
Juhendaja:
Ph.D. Grjaznova D.V.
Perm, 2010
Mikroobse päritoluga lüütilised ensüümid 5
Avastamise ajalugu 5
Bakteriolüütiliste ensüümide lokaliseerimine ja füsioloogiline roll bakterikultuurides 6
Bakteriraku seinte struktuuri mõju ensüümide lüütilisele võimele 7
Bakteriraku seinte peptidoglükaan. kaheksa
Bakteriolüütiliste ensüümide substraadi spetsiifilisus 9
Bakteriolüütilise kompleksi "Lüsoamidaas" avastamine 10
Lüsoamidaasi kasutamise väljavaated meditsiinis 10
LÜSOSÜÜM 12
Lüüsi mehhanism 13
Järeldus. viisteist
Kirjandus. kuusteist
Mikroobse biomassi hävitamiseks on teada mitmesuguseid füüsikalisi ja biokeemilisi meetodeid. Ensümaatiline meetod rakuseinte hävitamiseks võimaldab erinevalt füüsikalis-keemilistest meetoditest rakkudele kontrollitud toimet ja nendest sihtproduktide eraldamist.
Mikroorganismide toodetud ensüümide hulgas on eriline koht lüütilistel ensüümidel, mis katalüüsivad mikroobide rakuseina struktuurielementide järjestikuse lagunemise biokeemilisi reaktsioone.
Lüütiliste ensüümpreparaatide kasutamine võimaldab intensiivistada paljude väärtuslike füsioloogiliselt aktiivsete ainete vabanemist mikroobide biomassist: ensüümid, vitamiinid, aminohapped jne. On teada, et söödapärmi rakusein takistab pärmi tsütoplasmaatiliste ainete imendumist. rakk loomadele söötmisel. Söödapärmi biomassil pärast rakuseinte ensümaatilist lüüsimist on suurenenud toiteväärtus, mis võimaldab seda tõhusamalt kasutada söödatootmises, sh täispiimaasendajatena noortele põllumajandusloomadele.
Samuti saab lüütilisi ensüüme kasutada keskkonnakaitsetehnoloogiates, mikroobse biomassi, mis on mikrobioloogilise tootmise raiskamine, kasutamise etappides.
Lisaks on hiljuti välja töötatud lüütilistel ensüümidel põhinevaid antimikroobseid ravimeid, sealhulgas dermatomükoosi raviks kasutatavaid ravimeid, millel on keemiliselt sünteesitud fungitsiidide ees mitmeid eeliseid. Positiivseid tulemusi on saadud nende kasutamisel põllumajandusloomade seedekulgla haiguste ravis. Lüütiliste ensüümide kasutamine on paljulubav võitluses stafülokoki infektsiooniga, hambakaariese ravis.
Ensüümide tööstusliku tootmise loomisel pakuvad erilist huvi termotolerantsed mikroorganismid, sealhulgas aktinomütseedid - lüütiliste ensüümide tootjad, millel on kõrge kasvukiirus ja vastupidavus kultiveerimistemperatuuri muutustele. Samuti on oluline, et termotolerantsed kultuurid on sageli mikrofloora nakatamise osas konkurentsivõimelisemad kui mesofiilsed tootjad.
Selgus, et rakuseina hävitavaid (lüütilisi) ensüüme leidub märkimisväärses koguses neis struktuurides endis, nende toimeobjektide vahetus läheduses. Selliseid ensüüme nimetatakse endogeenseteks (rakusiseseks). Lisaks on kindlaks tehtud, et osa lüütilisi ensüüme on eksogeensed, st erituvad (eralduvad) neid moodustavate organismide elupaika.
Kui rääkida bakteriolüütiliste ensüümide paiknemisest bakterikultuuris, siis tuleks need selles osas ennekõike kolme rühma jagada.
Esimene rühm koosneb autolüsiinid - bakteriolüütilised ensüümid, mis on alati olemas (aktiivses või mitteaktiivses olekus) rakuseinas endas. Nad osalevad bakterirakkude kasvu ja diferentseerumise protsessis. Ilmselt on bakterirakus normis seos rakuseina komponente hävitavate ja sünteesivate ensüümide aktiivsuse vahel. Tõepoolest, äsja sünteesitud materjalide inkorporeerimine rakuseina ei saa toimuda ilma teatud keemiliste sidemete eelneva lõhustamiseta.
Seina lüüsi ja biosünteesi protsessid toimuvad samaaegselt bakteriraku kasvu ja arenguga ning alles hilisemates arengufaasides, kui biosünteesiprotsessid raugevad ja lüütiliste ensüümide aktiivsus jääb samaks, toimub bakteriraku lüüs.
Teise rühma kuuluvad bakterite spooride lüütilised ensüümid . Need aktiveeruvad koos teiste ensüümidega, mis osalevad biopolümeeride lagundamisel eoste tekke (eoste moodustumise) perioodil ja bakterite eoste idanemise ajal. Need ensüümid osalevad bakteriraku kesta hävitamise protsessides ja autolüsiinidena bakteriraku kasvu- ja morfogeneesiprotsessides.
Lõpuks on kolmas rühm ekstratsellulaarsed lüütilised ensüümid . Nende bioloogiline roll näib seisnevat selles, et selliseid ensüüme sünteesivatel ja keskkonda sekreteerivatel bakteritel on teiste bakterite ees eelis, eelkõige toiduallikates. Teiste bakterite rakke hävitades kasutab lüütilisi ensüüme tootv bakter oma vajadusteks aminohappeid, süsivesikuid ja muid lüüsitud raku komponente. Lisaks on sellel bakteriolüütiliste ensüümide rühmal kindlasti oluline roll neid ensüüme keskkonda eritavate rakkude kaitsmisel teiste samas ökoloogilises nišis elavate bakterite eest.
Osades grampositiivsetes bakterites (näiteks Staphylococcus aureus) koosnevad teikhoiinhapped mitmekümnest ribitoolfosfaadi molekulist – ribitoolteikohapetest, teistes grampositiivsetes bakterites koosnevad need biopolümeerid glütseroolfosfaadi molekulidest (glütseroolteihooinhappe molekulidest). Teichoiinhappeid leidub ainult grampositiivsetes bakterites.
Peamine erinevus grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite kestade struktuuris seisneb selles, et viimases on lisaks tsütoplasmaatilisele ka nn välismembraan. See õhukese, ühe-kolmekihilise peptidoglükaanikoti (8 nm) kohal paiknev struktuur on tüüpiline kahekihiline membraan, milles on tuvastatud üsna palju üsna ainulaadseid komponente: lipopolüsahhariide, lipoproteiine, aga ka valke. poriinid, millest moodustuvad poorid välismembraanis, võimaldades tungida kesta (ja sealt keskkonda) suhteliselt madala molekulmassiga ühendeid.
Bakteriolüütilised ensüümid ei saa hüdrolüüsida peptidoglükaani kihti gramnegatiivsete bakterite tervetes rakkudes ilma välismembraani eemaldamata, mida saab saavutada ainult nende rakkude töötlemisel kelaativate ainete, detergentide või füüsikaliste meetoditega.
Nagu eespool mainitud, koosneb peptidoglükaan polüsahhariidahelatest ja peptiidsildadest, mis ühendavad kogu struktuuri üheks "kotiks", mis ümbritseb bakterirakku väljastpoolt. Polüsahhariidi (glükaani) ahelad moodustuvad kahe "tellise" – lämmastikku sisaldavate glükoosiderivaatide: N-atsetüülglükoosamiini ja N-atsetüülmuraamhappe – vaheldumisel ning kujutavad üldiselt kitiinitaolist struktuuri. See on huvitav evolutsioonilisest aspektist, kuna kitiin ja kitiinitaolised struktuurid on levinud peaaegu kõigis elumaailma esindajates (v.a ainult taimed) ja on üks levinumaid biopolümeere Maal.
Peptidoglükaanglükaani ahelate struktuur on enamikul uuritud bakteritel sama. Peptiidglükaani peptiidosa erinevates bakterites võib oluliselt erineda. Kuid kõigil juhtudel moodustub see 4-5 L- või D-aminohapete jäägist. Need lühikesed peptiidid on ühelt poolt ühendatud nende vaba NH2-rühma kaudu amiidsideme kaudu muramiinhappe karboksüülrühmaga ja teisest küljest on nad seotud külgneva glükaaniahela sama lühikese peptiidiga. Grampositiivsetes bakterites, eriti Staphylococcus aureus'es, ei seostu glükaaniahelatega seotud peptiidid üksteisega otse, vaid täiendava peptiidi, nn ristsiduva silla osalusel. Staphylococcus aureus'es koosneb see peptiidsild viiest kõige lihtsama aminohappe glütsiini molekulist. Selliste sildade olemasolu grampositiivsete bakterite peptidoglükaani struktuuris muudab selle tihedamaks, mis on üks olulisemaid põhjuseid, miks need rakud Grami värvimisel värvainet kinni hoiavad. Teatud sidemete hüdrolüüs (lõhustamine veega) peptidoglükaanis põhjustab rakuseina lagunemist ja bakterite lüüsi.
Praegu on meditsiini üks olulisemaid probleeme meditsiinipraktikas kasutatavate antibiootikumide suhtes resistentsete (immuunsuse) patogeensete bakterite väga kiire tekkimine kliinilistes vormides. Näiteks enamikus nii Venemaa kui ka teiste riikide sünnitusmajades on ülaltoodud põhjustel üha raskem võidelda mädaste infektsioonidega, mida põhjustavad eelkõige sellised bakterid nagu stafülokokid ja streptokokid. Siiski on ravim lüsoamidaas osutunud väga tõhusaks stafülokokkide ja teiste grampositiivsete patogeensete bakterite multiresistentsete tüvede lüüsimisel.
Lüsoamidaas tapab tõhusalt kliinilised tüved, mida peaaegu kõik Venemaa kliinikutes kasutatavad antibiootikumid ei mõjuta mis tahes kontsentratsioonis. Selle ravimi edasised biomeditsiinilised ja kliinilised uuringud viisid arstid järeldusele, et lüsoamidaas on suurepärane vahend mädaste infektsioonide vastu võitlemiseks. Seda saab laialdaselt kasutada mädakirurgias, hambaravis, günekoloogias raskesti paranevate troofiliste haavandite ravis jne. Praegu on ravim meditsiinipraktikas kasutamiseks heaks kiidetud ja selle tootmine on asutatud Võšnevolotski meditsiinilistel eesmärkidel ensüümpreparaatide tehases.
Ravimi biomeditsiinilisel ja kliinilisel testimisel selgus, et sellel pole mitte ainult lüütilist toimet patogeensetele bakteritele, vaid see puhastab hästi ka haavu nekrootilistest (surnud) kudedest ning stimuleerib ka haavade paranemist, omades võimsat immunostimuleerivat toimet.
Selgus, et haavade tõhus puhastamine nekrootilistest massidest (mis koosneb peamiselt denatureeritud valkudest) on seotud mitte ainult bakteriolüütiliste ensüümide, vaid ka proteaaside (valku lagundavate ensüümide) sisaldusega lüsoamidaasi preparaadis. Ja lüsoamidaasi immunostimuleeriv toime tuleneb polüsahhariidi olemasolust preparaadis. Polüsahhariidi olemasolu on lüsoamidaasi meditsiinis kasutamise võimaluse seisukohalt ülimalt oluline, kuna lüsoamidaasis sisalduvad bakteriolüütilised ensüümid on polüsahhariidiga elektrostaatiliselt seotud, mis viib nende olulise stabiliseerumiseni. Lüsoamidaasi bakteriolüütilised ensüümid, nagu ka nende teised varem tuntud analoogid, kaotavad pärast polüsahhariidist eraldamist mõne päeva pärast oma ensümaatilise aktiivsuse. Lüsoamidaasi osana säilitavad need ensüümid oma aktiivsuse külmas peaaegu muutumatuna mitu aastat, mis on meditsiiniliste preparaatide puhul kohustuslik nõue.
Avastas 1922. aastal Alexander Fleming ninaõõne limast ja seejärel paljudes inimkeha kudedes ja vedelikes (kõhred, põrn, leukotsüüdid, pisarad), taimedes (kapsas, naeris, redis, mädarõigas), mõnedes bakterites ja faagides ja suurimas koguses munavalges. Erinevatest allikatest pärinevad lüsosüümid erinevad struktuurilt, kuid on sarnased. Munavalge lüsosüüm on esimene ensüüm, mille kolmemõõtmeline struktuur tehti röntgendifraktsioonianalüüsiga ning selgus struktuuri ja toimemehhanismi seos (1965); need uuringud annavad olulise panuse ensümaatilise katalüüsi mehhanismide mõistmisse üldiselt.
Lüsosüüm on valk, mille molekulmass on umbes 14 000; ainus polüpeptiidahel koosneb 129 aminohappejäägist ja on volditud kompaktseks globuliks (30×30×45 Å). Polüpeptiidahela kolmemõõtmelist konformatsiooni toetab 4 disulfiid- (-S-S-) sidet. (Inimese piima lüsosüümis on neid 3, hane munavalges 2, neid ei ole T4 faagi lüsosüümis; mida rohkem disulfiidrühmi, seda lüsosüüm on stabiilsem, kuid vähem aktiivne.) Lüsosüümgloobul koosneb kahest osast, mida eraldavad lünk; ühes osas sisaldab enamik aminohappeid (leutsiin, isoleutsiin, trüptofaan jt) hüdrofoobseid rühmi, teistes on ülekaalus polaarsete rühmadega aminohapped (lüsiin, arginiin, asparagiinhape jt). Keskkonna polaarsus mõjutab kahe molekuli pilu pinnal paikneva karboksüülrühma (-COOH) ionisatsiooni selle erinevatest külgedest (vt joonis). Lüsosüüm toimib ühele bakteriseina põhikomponendile – komplekssele polüsahhariidile, mis koosneb kahte tüüpi aminosuhkrutest. Polüsahhariid sorbeerub lüsosüümmolekulil selle hüdrofoobsete ja hüdrofiilsete osade piiril olevasse pilusse nii, et ensüümiga seondub 6 aminosuhkrutsüklit ja üks neid ühendavatest glükosiidsidemetest (4 ja 5 tsükli vahel) on karboksüülide vahel. Lüsosüümi karboksüülide ja glükosiidsidemeid moodustavate aatomite vastastikmõju, samuti substraadi valentsnurkade moonutamise tõttu side aktiveerub ja katkeb. See viib bakteriraku membraani hävitamiseni.
Riis. Lüsosüümi struktuur. (N. A. Kravtšenko)
Glutamiinhappe (Glu35) ja asparagiinhappe (Asp52) jäägid on ensüümi funktsiooni jaoks kriitilised. Glu35 toimib prootoni doonorina substraadi glükosiidsideme purustamisel, sideme hävitamisel, samas kui Asp52 toimib nukleofiilina vaheühendi, glükosüülensüümi moodustumisel. Seejärel reageerib glükosüülensüüm veemolekuliga, mille tulemusena ensüüm naaseb algsesse olekusse ja tekib hüdrolüüsiprodukt.
Ravimit lüsosüümi kasutatakse silmade, ninaneelu, igemete, põletuste ravis, sünnitusabis jne. Toiduainetööstuses on see registreeritud toidu lisaainena E1105.
Ravimi lüsoamidaasi ja lüsosüümi näitel demonstreeritakse väljavaateid bakteriolüütiliste ensüümide kasutamiseks tõhusa raviainena patogeensete bakterite, sealhulgas antibiootikumide suhtes mitmekordse resistentsete bakterite vastu võitlemisel.
Vaatamata suurele huvile mikroorganismide ensümaatilise lüüsi probleemi vastu, ei ole Venemaal lüütiliste ensüümpreparaatide tööstuslikku tootmist. Seetõttu on lüütiliste ensüümide biosünteesi tingimuste uurimine ja lüütilise toimega ensüümpreparaadi saamise tehnoloogia väljatöötamine rahvamajanduse ja meditsiini erinevates sektorites kasutamiseks asjakohane ja perspektiivikas.
2. Saveliev E.P., Petrov G.I. Bakterite rakuseina struktuuri molekulaarsed alused // Advances in Biol.chemistry. 1978. T. 19. S. 106.
3. Zakharova I.Ya., Pavlova I.N. Mikroorganismide lüütilised ensüümid. Kiiev: Nauk. mõte, 1985.
4. Skryabin G.K., Kulaev I.S. Lüsoamidaas - väljakutse mikroobidele // Teadus NSV Liidus. 1990. nr 2. S. 52-53.
5. Kulaev I.S. Mikroobse päritoluga bakteriolüütilised ensüümid bioloogias ja meditsiinis. // SOZH, 1997, nr 3, lk. 23.–31.
6. Phillips D., Ensüümmolekuli kolmemõõtmeline struktuur, kogumikus: Molekulid ja rakud, trans. inglise keelest, c. 3, M., 1968;
7. Vikipeedia: vaba entsüklopeedia [Elektrooniline allikas]. – URL: http://ru.wikipedia.org/wiki/Lysozyme (juurdepääsu kuupäev: 15.05.2010)
8. Akadeemikud: elektroonilised entsüklopeediad [Elektrooniline allikas]. – URL: http://dic.academic.ru/dic.nsf/bse/103560/lysozyme (juurdepääsu kuupäev: 15.05.2010)
