Vrsta
Plaća
Molekularni biolozi proučavaju molekularne procese kao osnovu svih životnih procesa. Na temelju dobivenih rezultata razvijaju koncepte za korištenje biokemijskih procesa, na primjer, u medicinskim istraživanjima i dijagnostici ili u biotehnologiji. Osim toga, mogu biti uključeni u proizvodnju farmaceutskih proizvoda, razvoj proizvoda, osiguranje kvalitete ili farmaceutsko savjetovanje.
Molekularni biolozi mogu raditi u različitim područjima. Na primjer, oni se odnose na korištenje rezultata istraživanja za proizvodnju u područjima kao što su genetski inženjering, kemija proteina ili farmakologija (otkrivanje lijekova). U kemijskoj i farmaceutskoj industriji olakšavaju uvođenje novorazvijenih proizvoda iz istraživanja u proizvodnju, marketing proizvoda i savjetovanje korisnika.
U znanstvenim istraživanjima molekularni biolozi proučavaju kemijska i fizikalna svojstva organskih spojeva, kao i kemijske procese (u području staničnog metabolizma) u živim organizmima i objavljuju rezultate istraživanja. Na visokim učilištima podučavaju studente, pripremaju se za predavanja i seminare, provjeravaju pismene radove, polažu ispite. Samostalna znanstvena djelatnost moguća je tek nakon stjecanja magistarskih i doktorskih titula.
Molekularni biolozi nalaze poslove kao npr
Plaća koju primaju Molekularni biolozi u Njemačkoj je
(prema raznim statističkim uredima i službama za zapošljavanje u Njemačkoj)
Molekularni biolozi proučavaju molekularne procese kao osnovu svih životnih procesa. Na temelju dobivenih rezultata razvijaju koncepte za korištenje biokemijskih procesa, na primjer, u medicinskim istraživanjima i dijagnostici ili u biotehnologiji. Osim toga, mogu biti uključeni u proizvodnju farmaceutskih proizvoda, razvoj proizvoda, osiguranje kvalitete ili farmaceutsko savjetovanje.
Molekularna biologija ili molekularna genetika bavi se proučavanjem strukture i biosinteze nukleinskih kiselina te procesa povezanih s prijenosom i implementacijom tih informacija u obliku proteina. To omogućuje razumijevanje bolnih poremećaja tih funkcija i, moguće, njihovo izliječenje genskom terapijom. Postoje sučelja za biotehnologiju i genetski inženjering u kojima se jednostavni organizmi kao što su bakterije i kvasac stvaraju kako bi tvari od farmakološkog ili komercijalnog interesa bile komercijalno dostupne putem ciljanih mutacija.
Farmaceutska i kemijska industrija nudi brojna područja zapošljavanja za molekularne biologe. U industrijskom okruženju analiziraju procese biotransformacije ili razvijaju i poboljšavaju procese za mikrobiološku proizvodnju aktivnih sastojaka i farmaceutskih međuproizvoda. Osim toga, uključeni su u prijelaz novorazvijenih proizvoda iz istraživanja u proizvodnju. Svojim zadacima provjere osiguravaju da proizvodni pogoni, oprema, analitičke metode i svi koraci u proizvodnji osjetljivih proizvoda kao što su lijekovi uvijek zadovoljavaju tražene standarde kvalitete. Osim toga, molekularni biolozi savjetuju korisnike o korištenju novih proizvoda.
Za rukovodeće pozicije često je potreban magistarski program.
U području znanosti i istraživanja, molekularni biolozi bave se temama kao što su prepoznavanje, transport, savijanje i kodifikacija proteina u stanici. Rezultati istraživanja, koji čine osnovu za praktičnu primjenu u različitim područjima, objavljuju se i na taj način dostupni drugim znanstvenicima i studentima. Na skupovima i kongresima raspravljaju i prezentiraju rezultate znanstvenog djelovanja. Molekularni biolozi drže predavanja i seminare, usmjeravaju znanstveni rad i polažu ispite.
Samostalna istraživačka djelatnost zahtijeva magisterij i doktorat.
1. Uvod.
Predmet, zadaci i metode molekularne biologije i genetike. Vrijednost "klasične" genetike i genetike mikroorganizama u razvoju molekularne biologije i genetskog inženjeringa. Pojam gena u "klasičnoj" i molekularnoj genetici, njegova evolucija. Doprinos metodologije genetskog inženjeringa razvoju molekularne genetike. Primijenjena vrijednost genetskog inženjeringa za biotehnologiju.
2. Molekularna osnova nasljeđa.
Pojam stanice, njezin makromolekularni sastav. Priroda genetskog materijala. Povijest dokaza genetske funkcije DNK.
2.1. Različite vrste nukleinskih kiselina. Biološke funkcije nukleinskih kiselina. Kemijska struktura, prostorna struktura i fizikalna svojstva nukleinskih kiselina. Značajke strukture genetskog materijala pro- i eukariota. Komplementarni parovi baza Watson-Crick. Genetski kod. Povijest dekodiranja genetskog koda. Glavna svojstva koda: trojnost, kod bez zareza, degeneracija. Značajke kodnog rječnika, obitelji kodona, semantičkih i "besmislenih" kodona. Kružne molekule DNA i koncept supersmotanja DNA. DNA topoizomeri i njihovi tipovi. Mehanizmi djelovanja topoizomeraza. DNA giraza bakterija.
2.2. DNK transkripcija. RNA polimeraza prokariota, njezine podjedinice i trodimenzionalne strukture. Raznolikost sigma faktora. Prokariotski promotor gena, njegovi strukturni elementi. Faze transkripcijskog ciklusa. Pokretanje, formiranje "otvorenog kompleksa", elongacija i završetak transkripcije. Slabljenje transkripcije. Regulacija ekspresije triptofanskog operona. "Ribo prekidači". Mehanizmi terminacije transkripcije. Negativna i pozitivna regulacija transkripcije. Laktoza operon. Regulacija transkripcije u razvoju lambda faga. Principi prepoznavanja DNK regulatornim proteinima (CAP protein i represor lambda faga). Značajke transkripcije u eukariota. Obrada RNA u eukariota. Pokrivanje, spajanje i poliadenilacija transkripata. Mehanizmi za spajanje. Uloga malih nuklearnih RNA i proteinskih faktora. Alternativno spajanje, primjeri.
2.3. Emitiranje, njegove faze, funkcija ribosoma. Lokalizacija ribosoma u stanici. Prokariotski i eukariotski tipovi ribosoma; 70S i 80S ribosomi. Morfologija ribosoma. Podjela na podčestice (podjedinice). Kodon-ovisno vezanje aminoacil-tRNA u ciklusu elongacije. Interakcija kodon-antikodon. Učešće faktora elongacije EF1 (EF-Tu) u vezivanju aminoacil-tRNA na ribosom. Faktor produljenja EF1B (EF-Ts), njegova funkcija, slijed reakcija s njegovim sudjelovanjem. Antibiotici koji utječu na fazu kodonu ovisnog vezanja aminoacil-tRNA na ribosom. Aminoglikozidni antibiotici (streptomicin, neomicin, kanamicin, gentamicin itd.), njihov mehanizam djelovanja. Tetraciklini kao inhibitori vezanja aminoacil-tRNA na ribosom. Početak emitiranja. Glavne faze procesa inicijacije. Pokretanje translacije u prokariota: inicijacijski čimbenici, inicijacijski kodoni, 3-kraj RNA male ribosomske podjedinice i Shine-Dalgarno sekvenca u mRNA. Pokretanje translacije u eukariota: inicijacijski čimbenici, inicijacijski kodoni, 5 ¢ neprevedena regija i "terminalna" inicijacija ovisno o kapu. "Unutarnja" inicijacija neovisna o kapu u eukariota. Transpeptidacija. Inhibitori transpeptidacije: kloramfenikol, linkomicin, amicetin, streptogramini, anizomicin. Translokacija. Uključenost faktora elongacije EF2 (EF-G) i GTP. Inhibitori translokacije: fusidinska kiselina, viomicin, njihovi mehanizmi djelovanja. Prekid emitiranja. Terminacijski kodoni. Faktori terminacije proteina za prokariote i eukariote; dvije klase faktora prekida i njihovi mehanizmi djelovanja. Regulacija translacije u prokariota.
2.4. DNK replikacija i njegovu genetsku kontrolu. Polimeraze uključene u replikaciju, karakteristike njihove enzimske aktivnosti. Točnost reprodukcije DNK. Uloga steričkih interakcija između parova baza DNA tijekom replikacije. E. coli polimeraze I, II i III. Podjedinice polimeraze III. Replikacija fork, master i lag niti u replikaciji. Fragmenti Okazakija. Kompleks proteina u replikacijskoj vilici. Regulacija inicijacije replikacije u E. coli. Prestanak replikacije u bakterijama. Značajke regulacije replikacije plazmida. Dvosmjerna i kotrljajuća replikacija prstena.
2.5. Rekombinacija, njegove vrste i modeli. Opća ili homologna rekombinacija. Dvolančani DNK se lome i započinju rekombinaciju. Uloga rekombinacije u post-replikacijskom popravljanju dvolančanih prekida. Holliday struktura u modelu rekombinacije. Enzimologija opće rekombinacije u E. coli. RecBCD kompleks. RecA protein. Uloga rekombinacije u osiguravanju sinteze DNA u slučaju oštećenja DNK koja prekida replikaciju. Rekombinacija u eukariota. Rekombinacijski enzimi u eukariota. Rekombinacija specifična za mjesto. Razlike u molekularnim mehanizmima opće rekombinacije i rekombinacije specifične za mjesto. Klasifikacija rekombinaze. Vrste kromosomskih preuređivanja provedenih tijekom rekombinacije specifične za mjesto. Regulatorna uloga rekombinacije specifične za mjesto u bakterijama. Izgradnja kromosoma višestaničnih eukariota korištenjem sustava rekombinacije faga specifičnog za mjesto.
2.6. popravak DNK. Klasifikacija vrsta popravka. Izravna popravka timinskih dimera i metiliranog gvanina. Izrezivanje baza. Glikozilaza. Mehanizam popravka nesparenih nukleotida (popravak mismatch). Odabir lanca DNA koji treba popraviti. SOS popravak. Svojstva DNA polimeraza uključenih u popravak SOS u prokariota i eukariota. Koncept "prilagodljivih mutacija" u bakterijama. Popravak dvolančanih prekida: homologna post-replikativna rekombinacija i fuzija nehomolognih krajeva molekule DNA. Odnos između procesa replikacije, rekombinacije i popravka.
3. Mutacijski proces.
Uloga biokemijskih mutanata u formiranju teorije jednog gena - jednog enzima. Klasifikacija mutacija. Točkaste mutacije i kromosomski preustroj, mehanizam njihovog nastanka. Spontana i inducirana mutageneza. Klasifikacija mutagena. Molekularni mehanizam mutageneze. Odnos između mutageneze i popravka. Identifikacija i selekcija mutanata. Supresija: intragenska, intergenska i fenotipska.
4. Ekstrakromosomski genetski elementi.
Plazmidi, njihova struktura i klasifikacija. Spolni faktor F, njegova struktura i životni ciklus. Uloga faktora F u mobilizaciji kromosomskog prijenosa. Formiranje donora poput Hfr i F". Mehanizam konjugacije. Bakteriofagi, njihova struktura i životni ciklus. Virulentni i umjereni bakteriofagi. Lizogenija i transdukcija. Opća i specifična transdukcija. Migrirajući genetski elementi: transpozoni i IS-sekvencije, njihova uloga u genetskoj razmjeni DNA-transpozoni u genomima prokariota i eukariota IS-sekvencije bakterija, njihova struktura IS-sekvencije kao komponenta F-faktora bakterija, koji određuje sposobnost prijenosa genetskog materijala tijekom konjugacije Transpozoni bakterija i eukariotskih organizama Direct nereplikacijski i replikativni mehanizmi transpozicija Koncept horizontalnog prijenosa transposona i njihova uloga u strukturnim preustrojima (ektopična rekombinacija) i u evoluciji genoma.
5. Proučavanje strukture i funkcije gena.
Elementi genetske analize. Cis-trans komplementarni test. Genetsko mapiranje korištenjem konjugacije, transdukcije i transformacije. Izrada genetskih karata. Suptilno genetsko mapiranje. Fizikalna analiza strukture gena. Heterodupleksna analiza. Analiza ograničenja. Metode sekvenciranja. Lančana reakcija polimeraze. Identificiranje funkcije gena.
6. Regulacija ekspresije gena. Koncepti operona i regulona. Kontrola na razini inicijacije transkripcije. Promotor, operator i regulatorni proteini. Pozitivna i negativna kontrola ekspresije gena. Kontrola na razini terminacije transkripcije. Operaoni kontrolirani katabolitima: modeli operona laktoze, galaktoze, arabinoze i maltoze. Operaoni kontrolirani atenuatorom: model triptofanskog operona. Multivalentna regulacija ekspresije gena. Globalni sustavi regulacije. Regulatorni odgovor na stres. Post-transkripcijska kontrola. Sigal transdukcija. Regulacija posredovana RNA: male RNA, senzorne RNA.
7. Osnove genetskog inženjeringa. Restrikcioni i modifikacijski enzimi. Izolacija i kloniranje gena. Vektori za molekularno kloniranje. Principi izgradnje rekombinantne DNA i njihovo uvođenje u stanice primatelja. Primijenjeni aspekti genetskog inženjeringa.
1. Watson J., Ace J., Rekombinantna DNK: kratki tečaj. - M .: Mir, 1986.
2. Geni. - M .: Mir. 1987.
3. Molekularna biologija: struktura i biosinteza nukleinskih kiselina. / Ed. ... - M. Viša škola. 1990.
4., - Molekularna biotehnologija. M. 2002. godine.
5. Spirinski ribosomi i biosinteza proteina. - M .: Viša škola, 1986.
1. Khesin genoma. - M .: Znanost. 1984.
2. Rybchinov genetski inženjering. - SPb .: SPbSTU. 1999.
3. Patrušev gena. - M .: Nauka, 2000.
4. Moderna mikrobiologija. Prokarioti (u 2 svezaka). - M .: Mir, 2005.
5. M. Singer, P. Berg. Geni i genomi. - M .: Mir, 1998.
6. Inženjering orašara. - Novosibirsk: Iz Sib. Sveučilište, 2004. (monografija).
7. Stepanov biologija. Struktura i funkcija proteina. - M .: V. Sh., 1996.
Molekularna biologija / m ə lɛ DoJʊ lər / je grana biologije koja se bavi molekularnom osnovom biološke aktivnosti između biomolekula u različitim staničnim sustavima, uključujući interakcije između DNA, RNA, proteina i njihovu biosintezu, kao i regulaciju tih interakcija. Upis u priroda 1961. Astbury je opisao molekularnu biologiju:
Ne toliko tehnika koliko pristup, pristup s gledišta takozvanih fundamentalnih znanosti s vodećom idejom traženja odgovarajućeg molekularnog plana ispod velikih manifestacija klasične biologije. Posebno se brine za oblicima biološke molekule i [...] pretežno trodimenzionalne i strukturne – što, međutim, ne znači da je riječ samo o doradi morfologije. U isto vrijeme mora istraživati genezu i funkciju.
Istraživači u području molekularne biologije koriste specifične metode prerastanja molekularne biologije, ali ih sve više kombiniraju s metodama i idejama iz genetike i biokemije. Ne postoji određena granica između ovih disciplina. To je ilustrirano u sljedećem dijagramu koji prikazuje jednu moguću vrstu odnosa između polja:
Jedna od najosnovnijih tehnika molekularne biologije za proučavanje funkcije proteina je molekularno kloniranje. U ovoj tehnici, DNA koja kodira protein od interesa klonira se lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i/ili restrikcijskim enzimima u plazmidu (ekspresijski vektor). Vektor ima 3 karakteristične značajke: podrijetlo replikacije, mjesto višestrukog kloniranja (MCS) i selektivni marker, obično otporan na antibiotike. Uzvodna mjesta za višestruko kloniranje su promotorske regije i mjesta inicijacije transkripcije koja reguliraju ekspresiju kloniranog gena. Ovaj plazmid se može umetnuti u bakterijske ili životinjske stanice. Uvođenje DNA u bakterijske stanice može se izvesti transformacijom korištenjem gole DNA preuzimanja, konjugacijom korištenjem kontakta stanica-stanica, ili transdukcijom pomoću virusnog vektora. Uvođenje DNA u eukariotske stanice, kao što su životinjske stanice, fizičkim ili kemijskim putem naziva se transfekcija. Dostupno je nekoliko različitih metoda transfekcije, kao što su transfekcija kalcijevim fosfatom, elektroporacija, mikroinjekcija i liposomska transfekcija. Plazmid se može integrirati u genom, što rezultira stabilnom transfekcijom, ili može ostati neovisan o genomu, što se naziva prolazna transfekcija.
Proteini koji kodiraju DNA od interesa su sada unutar stanice i proteini se sada mogu eksprimirati. Različiti sustavi kao što su inducibilni promotori i specifični stanični signalni čimbenici pomažu u izražavanju interesa za proteine na visokim razinama. Velike količine proteina tada se mogu dobiti iz bakterijske ili eukariotske stanice. Protein se može testirati na enzimsku aktivnost u različitim situacijama, protein se može kristalizirati tako da se može proučavati njegova tercijarna struktura, ili, u farmaceutskoj industriji, može se proučavati aktivnost novih lijekova protiv proteina.
Pojmovi sjeverne , Zapad i orijentalni blotting dobiva od onoga što je izvorno molekularna biologija bila šala koja se igrala s tim pojmom Southernnet, slijedeći proceduru koju je opisao Edwin Southern za BLOTTED DNA hibridizaciju. Patricia Thomas, razvojnica RNA blotinga, koja je tada postala poznata kao sjever - blotting, nemoj baš koristiti taj izraz.
Nazvan po svom izumitelju, biologu Edwinu Southu, Southern blot je metoda za ispitivanje prisutnosti specifične sekvence DNK u uzorku DNK. Uzorci DNK prije ili nakon digestije restrikcijskim enzimom (restrikcijskim enzimima) odvajaju se gel elektroforezom, a zatim se prenose na membranu upijanjem kapilarnim djelovanjem. Membrana se zatim izlaže obilježenoj DNA sondi koja ima bazni slijed komplementaran onom na DNK od interesa. Southern blotting se manje koristi u znanstvenom laboratoriju zbog sposobnosti drugih metoda, kao što je PCR, da otkriju specifične sekvence DNK iz uzoraka DNK. Te se mrlje još uvijek koriste za neke primjene, međutim, kao što je mjerenje broja transgenskih kopija kod transgenih miševa ili u genskom inženjeringu nokautiranih linija embrionalnih matičnih stanica.
Northern blot grafikon
Klinička istraživanja i medicinske terapije koje proizlaze iz molekularne biologije djelomično su pokrivene genskom terapijom. Primjena pristupa molekularne biologije ili molekularne stanične biologije u medicini danas se naziva molekularna medicina. Molekularna biologija također igra važnu ulogu u razumijevanju formiranja, djelovanja i regulacije različitih dijelova stanica, koji se mogu koristiti za učinkovito ciljanje novih lijekova, dijagnosticiranje bolesti i razumijevanje fiziologije stanice.
Molekularna biologija doživjela je razdoblje brzog razvoja vlastitih istraživačkih metoda, koje je sada razlikuju od biokemije. To uključuje, posebice, metode genetskog inženjeringa, kloniranja, umjetne ekspresije i izbacivanja gena. Budući da je DNK materijalni nositelj genetskih informacija, molekularna biologija postala je mnogo bliža genetici, a na spoju je nastala molekularna genetika, koja je i grana genetike i molekularne biologije. Kao što molekularna biologija široko koristi viruse kao istraživački alat, u virologiji se metode molekularne biologije koriste za rješavanje njihovih problema. Za analizu genetskih informacija uključena je računalna tehnologija, u vezi s kojom su se pojavili novi smjerovi molekularne genetike, koji se ponekad smatraju posebnim disciplinama: bioinformatikom, genomikom i proteomikom.
Ovo temeljno otkriće pripremljeno je dugom fazom istraživanja genetike i biokemije virusa i bakterija.
Godine 1928. Frederick Griffith je po prvi put pokazao da ekstrakt patogenih bakterija ubijenih toplinom može prenijeti patogenost na neopasne bakterije. Proučavanje transformacije bakterija kasnije je dovelo do pročišćavanja patogenog agensa, za koji se, suprotno očekivanjima, pokazalo da nije protein, već nukleinska kiselina. Sama po sebi, nukleinska kiselina nije opasna, ona samo prenosi gene koji određuju patogenost i druga svojstva mikroorganizma.
50-ih godina XX. stoljeća pokazalo se da bakterije imaju primitivni spolni proces, da su sposobne razmjenjivati ekstrakromosomsku DNK, plazmide. Otkriće plazmida, kao i transformacija, činilo je osnovu plazmidne tehnologije raširene u molekularnoj biologiji. Drugo važno metodološko otkriće bilo je otkriće bakterijskih virusa i bakteriofaga početkom 20. stoljeća. Fagi također mogu prenositi genetski materijal iz jedne bakterijske stanice u drugu. Infekcija bakterija fagima dovodi do promjene u sastavu bakterijske RNK. Ako je, bez faga, sastav RNA sličan sastavu bakterijske DNK, tada nakon infekcije RNK postaje sličnija DNK bakteriofaga. Tako je utvrđeno da je struktura RNA određena strukturom DNK. Zauzvrat, brzina sinteze proteina u stanicama ovisi o količini kompleksa RNA-protein. Tako je formulirano središnja dogma molekularne biologije: DNA ↔ RNA → protein.
Daljnji razvoj molekularne biologije bio je popraćen kako razvojem njene metodologije, posebice izumom metode za određivanje nukleotidnog slijeda DNK (W. Gilbert i F. Senger, Nobelova nagrada za kemiju, 1980.), tako i novim otkrića u području proučavanja strukture i funkcioniranja gena (vidi. Povijest genetike). Početkom 21. stoljeća dobiveni su podaci o primarnoj strukturi cjelokupne ljudske DNK i niza drugih organizama najvažnijih za medicinu, poljoprivredu i znanstvena istraživanja, što je dovelo do pojave nekoliko novih pravaca u biologiji: genomike, bioinformatike. , itd.
Zaklada Wikimedia. 2010.
MOLEKULARNA BIOLOGIJA- studij DOS. svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Najvažniji pravci u M. b. su studije strukturne i funkcionalne organizacije genetskog aparata stanica i mehanizma realizacije nasljednih informacija ... ... Biološki enciklopedijski rječnik
MOLEKULARNA BIOLOGIJA- istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Saznaje kako i u kojoj mjeri su rast i razvoj organizama, pohranjivanje i prijenos nasljednih informacija, transformacija energije u živim stanicama, itd. fenomeni uzrokovani ... Veliki enciklopedijski rječnik
MOLEKULARNA BIOLOGIJA Moderna enciklopedija
MOLEKULARNA BIOLOGIJA- MOLEKULARNA BIOLOGIJA, biološko proučavanje strukture i funkcioniranja MOLEKULA koje čine žive organizme. Glavna područja proučavanja su fizikalna i kemijska svojstva bjelančevina i NUKLEINSKIH KISELINA poput DNK. vidi također… … Znanstveno-tehnički enciklopedijski rječnik
molekularna biologija- dio biol., koji istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Saznaje kako i u kojoj mjeri dolazi do rasta i razvoja organizama, skladištenja i prijenosa nasljednih informacija, transformacije energije u živim stanicama i ... ... Mikrobiološki rječnik
molekularna biologija- - Teme biotehnologije EN molekularna biologija ... Vodič za tehničkog prevoditelja
Molekularna biologija- MOLEKULARNA BIOLOGIJA, istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Saznaje kako i u kojoj mjeri dolazi do rasta i razvoja organizama, skladištenja i prijenosa nasljednih informacija, transformacije energije u živim stanicama i ... ... Ilustrirani enciklopedijski rječnik
Molekularna biologija- znanost koja kao svoju zadaću postavlja poznavanje prirode fenomena vitalne aktivnosti proučavanjem bioloških objekata i sustava na razini koja se približava molekularnoj razini, au nekim slučajevima čak i dostiže ovu granicu. Konačni cilj u ovom ... ... Velika sovjetska enciklopedija
MOLEKULARNA BIOLOGIJA- proučava fenomene života na razini makromolekula (hl. obr. proteina i nukleinske kiseline) u acelularnim strukturama (ribosomi i dr.), u virusima, kao i u stanicama. M.-ov gol. utvrđivanje uloge i mehanizma funkcioniranja ovih makromolekula na temelju ... ... Kemijska enciklopedija
molekularna biologija- istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Saznaje kako i u kojoj mjeri dolazi do rasta i razvoja organizama, skladištenja i prijenosa nasljednih informacija, transformacije energije u živim stanicama i drugih pojava ... ... enciklopedijski rječnik
Napredak u proučavanju nukleinskih kiselina i biosinteze proteina doveo je do stvaranja niza metoda koje su od velike primjene u medicini, poljoprivredi i nizu drugih industrija.
Nakon proučavanja genetskog koda i temeljnih principa pohranjivanja i realizacije nasljednih informacija, razvoj molekularne biologije zastao je u slijepoj ulici, jer nije bilo metoda koje bi mogle manipulirati genima, izolirati ih i promijeniti. Pojava ovih metoda dogodila se 1970-ih i 1980-ih godina. To je dalo snažan poticaj razvoju ovog područja znanosti, koje i danas cvjeta. Prije svega, ove se metode odnose na proizvodnju pojedinih gena i njihovo uvođenje u stanice drugih organizama (molekularno kloniranje i transgeneza, PCR), kao i metode za određivanje slijeda nukleotida u genima (sekvenciranje DNA i RNA). Ove metode će biti detaljnije razmotrene u nastavku. Počet ćemo s najjednostavnijom osnovnom metodom, elektroforezom, a zatim prijeći na naprednije metode.
Riječ je o osnovnoj DNK tehnici koja se koristi u sprezi s gotovo svim drugim metodama za izolaciju željenih molekula i analizu rezultata. Za razdvajanje fragmenata DNA po duljini koristi se metoda gel elektroforeze. DNK je kiselina, njezine molekule sadrže ostatke fosforne kiseline, koji odcjepljuju proton i dobivaju negativan naboj (slika 1.).
Stoga se u električnom polju molekule DNK kreću do anode – pozitivno nabijene elektrode. To se događa u otopini elektrolita koja sadrži ione nositelja naboja, tako da ova otopina provodi struju. Za odvajanje fragmenata koristi se gusti polimerni gel (agaroza ili poliakrilamid). Molekule DNK se u njega "zapliću" što su duže, pa se stoga najduže molekule kreću najsporije, a najkraće - najbrže (sl. 2). Prije ili nakon elektroforeze, gel se tretira bojama koje se vežu na DNA i fluoresciraju u ultraljubičastom svjetlu, te se dobiva uzorak traka u gelu (vidi sliku 3). Kako bi se odredile duljine fragmenata DNA uzorka, uspoređuju se s markerom - skupom fragmenata standardnih duljina nanesenih paralelno na isti gel (slika 4.).
Najvažniji alati za rad s DNA su enzimi koji transformiraju DNK u živim stanicama: DNA polimeraze, DNA ligaze i restrikcijske endonukleaze, odnosno restrikcijski enzimi. DNA polimeraza provoditi matričnu sintezu DNA, što omogućuje umnožavanje DNK u epruveti. DNA ligaze spojiti molekule DNK ili zacijeliti praznine u njima. Restrikcijske endonukleaze, ili restrikcijskim enzimima, izrezati molekule DNA prema strogo definiranim sekvencama, što vam omogućuje izrezivanje pojedinačnih fragmenata iz ukupne mase DNK. Ovi fragmenti mogu u nekim slučajevima sadržavati zasebne gene.
Sekvence koje prepoznaju restrikcijske endonukleaze su simetrične, a prekidi mogu nastati u sredini takve sekvence ili s pomakom (na istom mjestu u oba lanca DNA). Shema djelovanja različitih vrsta restrikcijskih enzima prikazana je na Sl. 1. U prvom slučaju dobivaju se takozvani "tupi" krajevi, a u drugom "ljepljivi" krajevi. U slučaju "ljepljivih" krajeva dna, lanac se ispostavlja kraćim od drugog; formira se jednolančani dio sa simetričnim slijedom identičnim na oba kraja.
Završne sekvence će biti iste kada se bilo koja DNA cijepa danim restrikcijskim enzimom i mogu se ponovno povezati budući da imaju komplementarne sekvence. Mogu se spojiti zajedno pomoću DNA ligaze i dobiti jednu molekulu. Tako je moguće kombinirati fragmente dvije različite DNK i dobiti tzv rekombinantna DNK... Ovaj pristup se koristi u metodi molekularnog kloniranja, što vam omogućuje da dobijete pojedinačne gene i uvedete ih u stanice koje mogu formirati protein kodiran u genu.
Molekularno kloniranje koristi dvije molekule DNK - umetak koji sadrži gen od interesa, i vektor- DNK služi kao nosač. Umetak se "ušije" u vektor pomoću enzima kako bi se dobila nova, rekombinantna molekula DNA, zatim se ta molekula unosi u stanice domaćina i te stanice formiraju kolonije na hranjivom mediju. Kolonija je potomak jedne stanice, odnosno klon, sve stanice u koloniji su genetski identične i sadrže istu rekombinantnu DNK. Otuda i pojam "molekularno kloniranje", odnosno dobivanje klona stanica koji sadrži fragment DNA koji nas zanima. Nakon što se dobiju kolonije koje sadrže umetak koji nas zanima, moguće je ovaj umetak karakterizirati različitim metodama, na primjer, odrediti njegov točan slijed. Stanice također mogu proizvesti protein kodiran umetkom ako sadrži funkcionalni gen.
Kada se rekombinantna molekula unese u stanice, dolazi do genetske transformacije tih stanica. Transformacija- proces apsorpcije stanice organizma slobodne molekule DNA iz okoliša i njezino ugrađivanje u genom, što dovodi do pojave u takvoj stanici novih nasljednih osobina karakterističnih za organizam donora DNK. Na primjer, ako umetnuta molekula sadrži gen za otpornost na antibiotik ampicilin, tada će transformirane bakterije rasti u njegovoj prisutnosti. Prije transformacije, ampicilin je izazvao njihovu smrt, odnosno pojavila se nova osobina u transformiranim stanicama.
Vektor mora imati nekoliko svojstava:
Prvo, radi se o relativno maloj molekuli DNK kojom se lako manipulira.
Drugo, da bi se DNK očuvala i razmnožila u stanici, ona mora sadržavati određeni slijed koji osigurava njegovu replikaciju (podrijetlo replikacije, odnosno ishodište replikacije).
Treće, mora sadržavati genski biljeg, što osigurava odabir samo onih stanica u koje je vektor pao. Obično su to geni otpornosti na antibiotike – tada, u prisutnosti antibiotika, sve stanice koje ne sadrže vektor umiru.
Kloniranje gena najčešće se provodi u bakterijskim stanicama, jer ih je lako uzgajati i brzo se razmnožavaju. Bakterijska stanica obično sadrži jednu veliku kružnu molekulu DNA, dugu nekoliko milijuna parova nukleotida, koja sadrži sve gene potrebne za bakterije – bakterijski kromosom. Osim nje, u nekim bakterijama postoji mala (nekoliko tisuća parova baza) kružna DNK tzv plazmidi(sl. 2). Oni, kao i glavna DNK, sadrže slijed nukleotida koji osiguravaju sposobnost DNK da se replicira (ori). Plazmidi se repliciraju neovisno o glavnoj (kromosomskoj) DNK, stoga su prisutni u stanici u velikom broju kopija. Mnogi od ovih plazmida nose gene otpornosti na antibiotike kako bi razlikovali stanice koje nose plazmid od normalnih stanica. Češće se koriste plazmidi koji nose dva gena koji pružaju otpornost na dva antibiotika, na primjer, tetraciklin i amicilin. Postoje jednostavne metode za izolaciju takvih plazmidnih DNA slobodnih od DNK bakterijskog glavnog kromosoma.
Prijenos gena iz jednog organizma u drugi naziva se transgeneza i takvi modificirani organizmi - transgenski... Prijenosom gena u stanice mikroorganizama dobivaju se rekombinantni proteinski pripravci za potrebe medicine, a posebno humani proteini koji ne izazivaju imunološko odbacivanje - interferoni, inzulin i drugi proteinski hormoni, stanični faktori rasta, kao i proteini za proizvodnju cjepiva. U složenijim slučajevima, kada se modifikacija proteina odvija ispravno samo u eukariotskim stanicama, koriste se transgene stanične kulture ili transgene životinje, posebice stoka (prvenstveno koze), koja izlučuje potrebne proteine u mlijeko, ili se proteini izoliraju iz njihove krvi. . Tako se dobivaju antitijela, faktori zgrušavanja i drugi proteini. Metodom transgeneze dobivaju se usjevne biljke koje su otporne na herbicide i štetnike te imaju druga korisna svojstva. Uz pomoć transgenih mikroorganizama pročišćavaju otpadne vode i bore se protiv onečišćenja, čak postoje i transgeni mikrobi koji mogu razgraditi naftu. Osim toga, transgene tehnologije su nezamjenjive u znanstvenim istraživanjima – razvoj biologije danas je nezamisliv bez rutinske uporabe metoda modifikacije i prijenosa gena.
tehnologija molekularnog kloniranja
Za dobivanje pojedinačnog gena iz bilo kojeg organizma, sva kromosomska DNA se izolira iz njega i cijepa s jednim ili dva restrikcijska enzima. Enzimi su odabrani tako da ne režu gen koji nas zanima, već prave lomove duž njegovih rubova i naprave 1 prekid u plazmidnoj DNK u jednom od gena otpornosti, na primjer, na ampicilin.
Proces molekularnog kloniranja uključuje sljedeće korake:
Rezanje i šivanje - konstrukcija jedne rekombinantne molekule od umetka i vektora.
Transformacija je uvođenje rekombinantne molekule u stanice.
Odabir - odabir stanica koje su primile umetnuti vektor.
Plazmidna DNA se tretira istim restrikcijskim enzimima i pretvara se u linearnu molekulu ako se odabere takav restrikcijski enzim koji unosi 1 prazninu u plazmid. Kao rezultat toga, krajevi svih nastalih fragmenata DNK završavaju s istim ljepljivim krajevima. Kada se temperatura snizi, ovi krajevi se nasumično povezuju i ligiraju s DNA ligazom (vidi sliku 3).
Dobiva se mješavina kružnih DNK različitog sastava: neke od njih će sadržavati specifičan DNA slijed kromosomske DNK povezane s bakterijskom DNK, druge - fragmente kromosomske DNK povezane zajedno, a treće - reducirani kružni plazmid ili njegov dimer (sl. . 4).
Zatim se provodi ova smjesa genetska transformacija bakterije koje ne sadrže plazmide. Transformacija- proces apsorpcije stanice organizma slobodne molekule DNA iz okoliša i njezino ugrađivanje u genom, što dovodi do pojave u takvoj stanici novih nasljednih osobina karakterističnih za organizam donora DNK. Samo jedan plazmid može ući i razmnožavati se u svakoj stanici. Takve se stanice stavljaju na čvrsti hranjivi medij koji sadrži antibiotik tetraciklin. Stanice koje nisu dobile plazmid neće rasti na ovom mediju, a stanice koje nose plazmid formiraju kolonije od kojih svaka sadrži potomke samo jedne stanice, t.j. sve stanice u koloniji nose isti plazmid (vidi sliku 5).
Dalje, zadatak je odabrati samo ćelije u koje je pao vektor s umetkom, te ih razlikovati od stanica koje nose samo vektor bez umetanja ili ga uopće ne nose. Taj proces odabira željenih ćelija naziva se rasplod... Za to koristite selektivni markeri- obično geni otpornosti na antibiotike u vektoru, i selektivni mediji koji sadrže antibiotike ili druge tvari koje osiguravaju selekciju.
U našem primjeru, stanice iz kolonija uzgojenih u prisutnosti ampicilina su subkulturirane u dva medija: prvi sadrži ampicilin, a drugi tetraciklin. Kolonije koje sadrže samo plazmid će rasti na oba medija, dok kolonije koje sadrže umetnutu kromosomsku DNA u plazmidima na mediju s tetraciklinom neće rasti (slika 5). Među njima se posebnim metodama odabiru oni koji sadrže gen koji nas zanima, uzgajaju u dovoljnim količinama i izoliraju plazmidnu DNA. Iz njega se, korištenjem istih restrikcijskih enzima koji su korišteni za dobivanje rekombinantne DNA, izrezuje pojedinačni gen od interesa. DNK ovog gena može se koristiti za određivanje slijeda nukleotida, za uvođenje u organizam kako bi se dobila nova svojstva ili za sintetizaciju željenog proteina. Ova metoda izolacije gena tzv molekularno kloniranje.
Vrlo je prikladno koristiti fluorescentne proteine kao marker gene u studijama eukariotskih organizama. Gen prvog fluorescentnog proteina, zeleni fluorescentni protein (GFP) je izoliran iz meduze Aqeuorea victoria i uveden u različite modele organizama (vidi sliku 6). Godine 2008. O. Shimomura, M. Chalfi i R. Tsien dobili su Nobelovu nagradu za otkriće i korištenje ovog proteina.
Tada su izolirani geni drugih fluorescentnih proteina - crvene, plave, žute. Ovi geni su umjetno modificirani za proizvodnju proteina sa željenim svojstvima. Raznolikost fluorescentnih proteina prikazana je na Sl. 7, koja prikazuje Petrijevu zdjelicu s bakterijama koje sadrže gene za različite fluorescentne proteine.
primjena fluorescentnih proteina
Gen fluorescentnog proteina može se povezati s genom bilo kojeg drugog proteina, tada će se tijekom translacije formirati jedan protein - translacijski fuzijski protein, ili fuzije(fuzijski protein) koji fluorescira. Tako je moguće proučavati, na primjer, lokalizaciju (lokaciju) bilo kojeg proteina od interesa u stanici, njihovo kretanje. Ekspresijom fluorescentnih proteina samo u određenim tipovima stanica, moguće je označiti stanice ovih vrsta u višestaničnom organizmu (vidi sliku 8 - mišji mozak, u kojem pojedini neuroni imaju različite boje zbog određene kombinacije gena fluorescentnog proteini). Fluorescentni proteini su nezamjenjiv alat u modernoj molekularnoj biologiji.
Druga metoda dobivanja gena tzv lančana reakcija polimeraze (PCR)... Temelji se na sposobnosti DNA polimeraza da dovrše drugi lanac DNK duž komplementarnog lanca, kao što se to događa u stanicama tijekom replikacije DNA.
Podrijetlo replikacije u ovoj metodi definirano je s dva mala dijela DNK tzv sjemenke, ili temeljni premazi... Ti su početnici komplementarni krajevima gena od interesa na dva lanca DNA. Prvo se kromosomska DNK, iz koje se gen mora izolirati, pomiješa sa sjemenkama i zagrije na 99 ° C. To dovodi do pucanja vodikovih veza i divergencije lanaca DNK. Nakon toga, temperatura se snižava na 50-70 ° C (ovisno o duljini i redoslijedu sjemena). U tim uvjetima, početnici se vežu za komplementarne regije kromosomske DNA, tvoreći pravilnu dvostruku spiralu (vidi sliku 9). Nakon toga se dodaje mješavina sva četiri nukleotida potrebna za sintezu DNA i DNA polimeraze. Enzim produljuje prajmere izgradnjom dvolančane DNA odakle su prajmeri pričvršćeni, t.j. od krajeva gena do kraja jednolančane kromosomske molekule. 
Ako se smjesa sada ponovno zagrije, kromosomski i novosintetizirani lanci će se raspršiti. Nakon hlađenja, ponovno će im se pridružiti sjemenke koje se uzimaju u velikom višku (vidi sliku 10).
Na novosintetiziranim lancima oni će se vezati ne na kraj s kojeg je započela prva sinteza, već na suprotni kraj, budući da su lanci DNK antiparalelni. Stoga će u drugom ciklusu sinteze na takvim lancima biti dovršen samo slijed koji odgovara genu (vidi sliku 11).
Ova metoda koristi DNA polimerazu iz termofilnih bakterija, sposobnu izdržati vrenje i djelovati na temperaturama od 70-80°C, ne treba je dodavati svaki put, ali je dovoljno dodati na početku pokusa. Ponavljanjem postupaka zagrijavanja i hlađenja u istom slijedu, možemo u svakom ciklusu udvostručiti broj sekvenci koje su na oba kraja ograničene ubrizganim sjemenkama (vidi sliku 12).
Nakon otprilike 25 takvih ciklusa, broj kopija gena povećat će se više od milijun puta. Takve se količine lako mogu odvojiti od kromosomske DNK unesene u epruvetu i upotrijebiti u različite svrhe.
Drugo važno postignuće je razvoj metoda za određivanje slijeda nukleotida u DNK - DNK sekvenciranje(iz engleskog niza - sekvenca). Za to je potrebno dobiti gene čiste iz druge DNK jednom od opisanih metoda. Zatim se lančići DNA odvajaju zagrijavanjem i dodaje im se prajmer obilježen radioaktivnim fosforom ili fluorescentnom oznakom. Imajte na umu da se uzima jedno sjeme, komplementarno s jednom niti. Zatim se dodaju DNA polimeraza i smjesa od 4 nukleotida. Takva se smjesa podijeli na 4 dijela i svakome se doda jedan od nukleotida, modificiran tako da ne sadrži hidroksilnu skupinu na trećem atomu deoksiriboze. Ako je takav nukleotid uključen u sintetizirani lanac DNK, tada se njegovo produljenje neće moći nastaviti, jer polimeraza neće imati kamo pričvrstiti sljedeći nukleotid. Stoga se sinteza DNA prekida nakon uključivanja takvog nukleotida. Takvih nukleotida, zvanih dideoksinukleotidi, dodaje se mnogo manje od običnih, pa se završetak lanca događa samo povremeno i u svakom lancu na različitim mjestima. Rezultat je mješavina lanaca različitih duljina, s istim nukleotidom na kraju svakog. Dakle, duljina lanca odgovara broju nukleotida u proučavanom nizu, na primjer, ako smo imali adenil dideoksinukleotid, a rezultirajući lanci bili su dugi 2, 7 i 12 nukleotida, tada je u drugom genu bio adenin, sedmo i dvanaesto mjesto. Dobivena smjesa lanaca može se lako odvojiti po veličini pomoću elektroforeze, a sintetizirani lanci se mogu identificirati radioaktivnošću na rendgenskom filmu (vidi sliku 10).
Ispada da je slika prikazana na dnu slike, nazvana radio autogram. Krećući se po njoj odozdo prema gore i čitajući slovo iznad stupaca svake zone, dobivamo nukleotidni slijed prikazan na slici desno od autograma. Pokazalo se da sintezu ne zaustavljaju samo dideoksinukleotidi, već i nukleotidi u kojima je neka kemijska skupina, na primjer, fluorescentna boja, pričvršćena na treću poziciju šećera. Ako je svaki nukleotid označen svojom bojom, tada će zone dobivene tijekom odvajanja sintetiziranih lanaca svijetliti različitim svjetlom. To omogućuje da se reakcija provede u jednoj epruveti istovremeno za sve nukleotide i dijeljenjem dobivenih lanaca po duljini, nukleotidi se identificiraju po boji (vidi sliku 11).
Takve su metode omogućile određivanje sekvenci ne samo pojedinačnih gena, već i čitanje cijelih genoma. Sada su razvijene još brže metode za određivanje sekvenci nukleotida u genima. Ako je ljudski genom para dešifrirao veliki međunarodni konzorcij prvom zadanom metodom za 12 godina, drugom, drugom, za tri godine, sada se to može učiniti za mjesec dana. To omogućuje predvidjeti sklonost osobe mnogim bolestima i unaprijed poduzeti mjere za njihovo izbjegavanje.
