Molekularna biologija, znanost koja kao svoju zadaću postavlja poznavanje prirode fenomena života proučavajući biološke objekte i sustave na razini koja se približava molekularnoj, au nekim slučajevima čak i dostiže ovu granicu. Krajnji cilj je otkriti kako i u kojoj mjeri se javljaju karakteristične manifestacije života, kao što su nasljedstvo, reprodukcija vlastite vrste, biosinteza proteina, razdražljivost, rast i razvoj, pohrana i prijenos informacija, pretvorba energije, mobilnost itd. , nastaju zbog strukture, svojstava i međudjelovanja molekula biološki važnih tvari, prvenstveno dvije glavne klase biopolimera visoke molekularne težine - proteina i nukleinskih kiselina. Posebnost M. b. - proučavanje fenomena života na neživim predmetima ili onima koji su svojstveni najprimitivnijim manifestacijama života. To su biološke formacije sa stanične razine i ispod: substanične organele, kao što su izolirane stanične jezgre, mitohondriji, ribosomi, kromosomi, stanične membrane; nadalje - sustavi koji stoje na granici žive i nežive prirode - virusi, uključujući bakteriofage, i završavajući s molekulama najvažnijih komponenti žive tvari - nukleinskim kiselinama i proteinima.
Temelje na kojima se M. b. razvio postavile su takve znanosti kao što su genetika, biokemija, fiziologija elementarnih procesa itd. Prema podrijetlu svog razvoja, M. b. neraskidivo povezana s molekularnom genetikom, koja je i dalje važan dio
Posebnost M. b. je njegova trodimenzionalnost. M.-ova bit. M. Perutz to vidi u tumačenju bioloških funkcija u smislu molekularne strukture. M. b. postavlja svoju zadaću da dobije odgovore na pitanje "kako", saznavši bit uloge i sudjelovanja cjelokupne strukture molekule, te na pitanja "zašto" i "zašto", razjasnivši, s jedne strane, odnos između svojstava molekule (opet, prvenstveno proteina i nukleinskih kiselina) i funkcija koje ona obavlja te, s druge strane, uloge takvih pojedinačnih funkcija u općem kompleksu manifestacija vitalne aktivnosti.
Veliki napredak u molekularnoj biologiji. Ovdje je daleko od potpune liste ovih postignuća: otkrivanje strukture i mehanizma biološke funkcije DNK, svih vrsta RNA i ribosoma, otkrivanje genetskog koda; otkriće reverzne transkripcije, tj. sinteze DNA na RNA šabloni; proučavanje mehanizama funkcioniranja dišnih pigmenata; otkriće trodimenzionalne strukture i njezine funkcionalne uloge u djelovanju enzima, principa matriksne sinteze i mehanizama biosinteze proteina; otkrivanje strukture virusa i mehanizama njihove replikacije, primarne i, djelomično, prostorne strukture antitijela; izolacija pojedinih gena, kemijska, a zatim biološka (enzimska) sinteza gena, uključujući i ljudskog, izvan stanice (in vitro); prijenos gena iz jednog organizma u drugi, uključujući ljudske stanice; brzo napreduje dešifriranje kemijske strukture sve većeg broja pojedinačnih proteina, uglavnom enzima, kao i nukleinskih kiselina; otkrivanje fenomena "samosastavljanja" nekih bioloških objekata sve složenosti, počevši od molekula nukleinske kiseline i prelazeći na višekomponentne enzime, viruse, ribosome itd.; rasvjetljavanje alosterijskih i drugih temeljnih principa regulacije bioloških funkcija i procesa.
Problemi molekularne biologije. Uz naznačene važne zadatke M. b. (spoznavanje obrazaca "prepoznavanja", samosastavljanja i integracije) hitan smjer znanstvene potrage za blisku budućnost je razvoj metoda koje omogućuju dešifriranje strukture, a potom i trodimenzionalne, prostorne organizacije nukleinske kiseline visoke molekularne mase. Sve najvažnije metode, čija je uporaba osigurala nastanak i uspjeh medicinske znanosti, predložili su i razvili fizičari (ultracentrifugiranje, rendgenska strukturna analiza, elektronska mikroskopija, nuklearna magnetska rezonancija itd.). Gotovo svi novi fizikalni eksperimentalni pristupi (na primjer, uporaba računala, sinkrotronskog ili kočnog zračenja, laserske tehnologije i drugi) otvaraju nove mogućnosti za dubinsko proučavanje problema medicinske znanosti. Među najvažnijim problemima praktične prirode, na koje se odgovor očekuje od M. b., na prvom mjestu je problem molekularne osnove malignog rasta, zatim – načini prevencije, a možda i prevladavanja nasljednih bolesti – "molekularne bolesti". Razjašnjenje molekularne osnove biološke katalize, odnosno djelovanja enzima, bit će od velike važnosti. Među najvažnijim modernim pravcima M. b. treba uključiti želju za dešifriranjem molekularnih mehanizama djelovanja hormona, toksičnih i ljekovitih tvari, kao i za rasvjetljavanjem pojedinosti molekularne strukture i funkcioniranja takvih staničnih struktura kao što su biološke membrane uključene u regulaciju procesa prodiranja i transporta tvari. Dalji ciljevi M. b. - spoznaja prirode živčanih procesa, mehanizama pamćenja itd. Jedan od važnih novonastalih dijelova M. b. - tzv. genetski inženjering, koji kao svoju zadaću postavlja svrhovito djelovanje genetskog aparata (genoma) živih organizama, počevši od mikroba i nižih (jednostaničnih) i završavajući s ljudima (u potonjem slučaju, prvenstveno u svrhu radikalnog liječenja). nasljednih bolesti i korekcije genetskih defekata).
Najvažnija područja MB-a:
- Molekularna genetika - proučavanje strukturne i funkcionalne organizacije genetskog aparata stanice i mehanizma za implementaciju nasljednih informacija
- Molekularna virusologija - proučavanje molekularnih mehanizama interakcije virusa sa stanicama
- Molekularna imunologija - proučavanje obrazaca imunoloških reakcija tijela
- Molekularna razvojna biologija - proučavanje pojave različitih kvaliteta stanica tijekom individualnog razvoja organizama i specijalizacije stanica
Glavni predmeti istraživanja: Virusi (uključujući bakteriofage), Stanice i substanične strukture, Makromolekule, Višestanični organizmi.
Vrsta
Plaća
Molekularni biolozi proučavaju molekularne procese kao osnovu svih životnih procesa. Na temelju dobivenih rezultata razvijaju koncepte za korištenje biokemijskih procesa, na primjer, u medicinskim istraživanjima i dijagnostici ili u biotehnologiji. Osim toga, mogu biti uključeni u proizvodnju farmaceutskih proizvoda, razvoj proizvoda, osiguranje kvalitete ili farmaceutsko savjetovanje.
Molekularni biolozi mogu raditi u različitim područjima. Na primjer, oni se odnose na korištenje rezultata istraživanja za proizvodnju u područjima kao što su genetski inženjering, kemija proteina ili farmakologija (otkrivanje lijekova). U kemijskoj i farmaceutskoj industriji olakšavaju uvođenje novorazvijenih proizvoda iz istraživanja u proizvodnju, marketing proizvoda i savjetovanje korisnika.
U znanstvenim istraživanjima molekularni biolozi proučavaju kemijska i fizikalna svojstva organskih spojeva, kao i kemijske procese (u području staničnog metabolizma) u živim organizmima i objavljuju rezultate istraživanja. Na visokim učilištima podučavaju studente, pripremaju se za predavanja i seminare, provjeravaju pismene radove, polažu ispite. Samostalna znanstvena djelatnost moguća je tek nakon stjecanja magistarskih i doktorskih titula.
Molekularni biolozi nalaze poslove kao npr
Plaća koju primaju Molekularni biolozi u Njemačkoj je
(prema raznim statističkim uredima i službama za zapošljavanje u Njemačkoj)
Molekularni biolozi proučavaju molekularne procese kao osnovu svih životnih procesa. Na temelju dobivenih rezultata razvijaju koncepte za korištenje biokemijskih procesa, na primjer, u medicinskim istraživanjima i dijagnostici ili u biotehnologiji. Osim toga, mogu biti uključeni u proizvodnju farmaceutskih proizvoda, razvoj proizvoda, osiguranje kvalitete ili farmaceutsko savjetovanje.
Molekularna biologija ili molekularna genetika bavi se proučavanjem strukture i biosinteze nukleinskih kiselina te procesa povezanih s prijenosom i implementacijom tih informacija u obliku proteina. To omogućuje razumijevanje bolnih poremećaja tih funkcija i, eventualno, njihovo izliječenje genskom terapijom. Postoje sučelja za biotehnologiju i genetski inženjering u kojima se jednostavni organizmi kao što su bakterije i kvasac stvaraju kako bi tvari od farmakološkog ili komercijalnog interesa bile komercijalno dostupne putem ciljanih mutacija.
Farmaceutska i kemijska industrija nudi brojna područja zapošljavanja za molekularne biologe. U industrijskom okruženju analiziraju procese biotransformacije ili razvijaju i poboljšavaju procese za mikrobiološku proizvodnju aktivnih sastojaka i farmaceutskih međuproizvoda. Osim toga, uključeni su u prijelaz novorazvijenih proizvoda iz istraživanja u proizvodnju. Svojim zadacima provjere osiguravaju da proizvodni pogoni, oprema, analitičke metode i svi koraci u proizvodnji osjetljivih proizvoda kao što su lijekovi uvijek zadovoljavaju tražene standarde kvalitete. Osim toga, molekularni biolozi savjetuju korisnike o korištenju novih proizvoda.
Za rukovodeće pozicije često je potreban magistarski program.
U području znanosti i istraživanja, molekularni biolozi bave se temama kao što su prepoznavanje, transport, savijanje i kodifikacija proteina u stanici. Rezultati istraživanja, koji čine osnovu za praktičnu primjenu u različitim područjima, objavljuju se i na taj način dostupni drugim znanstvenicima i studentima. Na skupovima i kongresima raspravljaju i prezentiraju rezultate znanstvenog djelovanja. Molekularni biolozi drže predavanja i seminare, usmjeravaju znanstveni rad i polažu ispite.
Samostalna istraživačka djelatnost zahtijeva magisterij i doktorat.
Molekularna biologija doživjela je razdoblje brzog razvoja vlastitih istraživačkih metoda, koje je sada razlikuju od biokemije. To uključuje, posebice, metode genetskog inženjeringa, kloniranja, umjetne ekspresije i izbacivanja gena. Budući da je DNK materijalni nositelj genetskih informacija, molekularna biologija postala je mnogo bliža genetici, a na spoju je nastala molekularna genetika, koja je i grana genetike i molekularne biologije. Kao što molekularna biologija široko koristi viruse kao istraživački alat, u virologiji se metode molekularne biologije koriste za rješavanje njihovih problema. Za analizu genetskih informacija uključena je računalna tehnologija, u vezi s kojom su se pojavili novi smjerovi molekularne genetike, koji se ponekad smatraju posebnim disciplinama: bioinformatikom, genomikom i proteomikom.
Ovo temeljno otkriće pripremljeno je dugom fazom istraživanja genetike i biokemije virusa i bakterija.
Godine 1928. Frederick Griffith je po prvi put pokazao da ekstrakt patogenih bakterija ubijenih toplinom može prenijeti patogenost na neopasne bakterije. Proučavanje transformacije bakterija kasnije je dovelo do pročišćavanja patogenog agensa, za koji se, suprotno očekivanjima, pokazalo da nije protein, već nukleinska kiselina. Sama po sebi, nukleinska kiselina nije opasna, ona samo prenosi gene koji određuju patogenost i druga svojstva mikroorganizma.
50-ih godina XX. stoljeća pokazalo se da bakterije imaju primitivni spolni proces, da su u stanju razmjenjivati ekstrakromosomsku DNK, plazmide. Otkriće plazmida, poput transformacije, činilo je osnovu plazmidne tehnologije raširene u molekularnoj biologiji. Drugo važno metodološko otkriće bilo je otkriće bakterijskih virusa i bakteriofaga početkom 20. stoljeća. Fagi također mogu prenositi genetski materijal iz jedne bakterijske stanice u drugu. Infekcija bakterija fagima dovodi do promjene u sastavu bakterijske RNK. Ako je, bez faga, sastav RNA sličan sastavu bakterijske DNK, tada nakon infekcije RNK postaje sličnija DNK bakteriofaga. Tako je utvrđeno da je struktura RNA određena strukturom DNK. Zauzvrat, brzina sinteze proteina u stanicama ovisi o količini kompleksa RNA-protein. Tako je formulirano središnja dogma molekularne biologije: DNA ↔ RNA → protein.
Daljnji razvoj molekularne biologije bio je popraćen kako razvojem njene metodologije, posebice izumom metode za određivanje nukleotidnog slijeda DNK (W. Gilbert i F. Senger, Nobelova nagrada za kemiju, 1980.), tako i novim otkrića u području proučavanja strukture i funkcioniranja gena (vidi. Povijest genetike). Početkom 21. stoljeća dobiveni su podaci o primarnoj strukturi cjelokupne ljudske DNK i niza drugih organizama koji su najvažniji za medicinu, poljoprivredu i znanstvena istraživanja, što je dovelo do pojave nekoliko novih pravaca u biologiji: genomike. , bioinformatika itd.
Zaklada Wikimedia. 2010.
MOLEKULARNA BIOLOGIJA- studij DOS. svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Najvažniji pravci u M. b. su studije strukturne i funkcionalne organizacije genetskog aparata stanica i mehanizma realizacije nasljednih informacija ... ... Biološki enciklopedijski rječnik
MOLEKULARNA BIOLOGIJA- istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Saznaje kako i u kojoj mjeri su rast i razvoj organizama, pohranjivanje i prijenos nasljednih informacija, transformacija energije u živim stanicama, itd. fenomeni uzrokovani ... Veliki enciklopedijski rječnik
MOLEKULARNA BIOLOGIJA Moderna enciklopedija
MOLEKULARNA BIOLOGIJA- MOLEKULARNA BIOLOGIJA, biološko proučavanje strukture i funkcioniranja MOLEKULA koje čine žive organizme. Glavna područja proučavanja su fizikalna i kemijska svojstva bjelančevina i NUKLEINSKIH KISELINA poput DNK. vidi također… … Znanstveno-tehnički enciklopedijski rječnik
molekularna biologija- dio biol., koji istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Saznaje kako i u kojoj mjeri dolazi do rasta i razvoja organizama, skladištenja i prijenosa nasljednih informacija, transformacije energije u živim stanicama i ... ... Mikrobiološki rječnik
molekularna biologija- - Teme biotehnologije EN molekularna biologija ... Vodič za tehničkog prevoditelja
Molekularna biologija- MOLEKULARNA BIOLOGIJA, istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Saznaje kako i u kojoj mjeri dolazi do rasta i razvoja organizama, skladištenja i prijenosa nasljednih informacija, transformacije energije u živim stanicama i ... ... Ilustrirani enciklopedijski rječnik
Molekularna biologija- znanost koja kao svoju zadaću postavlja poznavanje prirode fenomena vitalne aktivnosti proučavanjem bioloških objekata i sustava na razini koja se približava molekularnoj razini, au nekim slučajevima čak i dostiže ovu granicu. Konačni cilj u ovom ... ... Velika sovjetska enciklopedija
MOLEKULARNA BIOLOGIJA- proučava fenomene života na razini makromolekula (hl. obr. proteina i nukleinske kiseline) u acelularnim strukturama (ribosomi i dr.), u virusima, kao i u stanicama. M.-ov gol. utvrđivanje uloge i mehanizma funkcioniranja ovih makromolekula na temelju ... ... Kemijska enciklopedija
molekularna biologija- istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Saznaje kako i u kojoj mjeri dolazi do rasta i razvoja organizama, pohranjivanja i prijenosa nasljednih informacija, transformacije energije u živim stanicama i drugih pojava ... ... enciklopedijski rječnik
Napredak u proučavanju nukleinskih kiselina i biosinteze proteina doveo je do stvaranja niza metoda koje su od velike primjene u medicini, poljoprivredi i nizu drugih industrija.
Nakon proučavanja genetskog koda i temeljnih principa pohranjivanja i realizacije nasljednih informacija, razvoj molekularne biologije zastao je u slijepoj ulici, jer nije bilo metoda koje bi mogle manipulirati genima, izolirati ih i promijeniti. Pojava ovih metoda dogodila se 1970-ih i 1980-ih godina. To je dalo snažan poticaj razvoju ovog područja znanosti, koje i danas cvjeta. Prije svega, ove se metode odnose na proizvodnju pojedinih gena i njihovo uvođenje u stanice drugih organizama (molekularno kloniranje i transgeneza, PCR), kao i metode za određivanje slijeda nukleotida u genima (sekvenciranje DNA i RNA). Ove metode će biti detaljnije razmotrene u nastavku. Počet ćemo s najjednostavnijom osnovnom metodom, elektroforezom, a zatim prijeći na naprednije metode.
Riječ je o osnovnoj DNK tehnici koja se koristi u sprezi s gotovo svim drugim metodama za izolaciju željenih molekula i analizu rezultata. Za razdvajanje fragmenata DNA po duljini koristi se metoda gel elektroforeze. DNK je kiselina, njezine molekule sadrže ostatke fosforne kiseline, koji odcjepljuju proton i dobivaju negativan naboj (slika 1.).
Stoga se u električnom polju molekule DNK kreću do anode – pozitivno nabijene elektrode. To se događa u otopini elektrolita koja sadrži ione nositelja naboja, tako da ova otopina provodi struju. Za odvajanje fragmenata koristi se gusti polimerni gel (agaroza ili poliakrilamid). Molekule DNK se u njega "zapliću" što su duže, pa se stoga najduže molekule kreću najsporije, a najkraće - najbrže (slika 2). Prije ili nakon elektroforeze, gel se tretira bojama koje se vežu na DNA i fluoresciraju u ultraljubičastom svjetlu, te se dobiva uzorak traka u gelu (vidi sliku 3). Da bi se odredile duljine fragmenata DNA uzorka, uspoređuju se s markerom - skupom fragmenata standardnih duljina nanesenih paralelno na isti gel (slika 4.).
Najvažniji alati za rad s DNA su enzimi koji transformiraju DNK u živim stanicama: DNA polimeraze, DNA ligaze i restrikcijske endonukleaze, odnosno restrikcijski enzimi. DNA polimeraza provoditi matričnu sintezu DNA, što omogućuje umnožavanje DNK u epruveti. DNA ligaze spojiti molekule DNK ili zacijeliti praznine u njima. Restrikcijske endonukleaze, ili restrikcijskim enzimima, izrezati molekule DNA prema strogo definiranim sekvencama, što vam omogućuje izrezivanje pojedinačnih fragmenata iz ukupne mase DNK. Ovi fragmenti mogu u nekim slučajevima sadržavati zasebne gene.
Sekvence koje prepoznaju restrikcijske endonukleaze su simetrične, a prekidi mogu nastati u sredini takve sekvence ili s pomakom (na istom mjestu u oba lanca DNA). Shema djelovanja različitih vrsta restrikcijskih enzima prikazana je na Sl. 1. U prvom slučaju dobivaju se takozvani "tupi" krajevi, a u drugom "ljepljivi" krajevi. U slučaju "ljepljivih" krajeva dna, lanac se ispostavlja kraćim od drugog; formira se jednolančani dio sa simetričnim nizom identičnim na oba kraja.
Završne sekvence će biti iste kada se bilo koja DNA cijepa danim restrikcijskim enzimom i mogu se ponovno povezati budući da imaju komplementarne sekvence. Mogu se spojiti zajedno pomoću DNA ligaze i dobiti jednu molekulu. Tako je moguće kombinirati fragmente dvije različite DNK i dobiti tzv rekombinantna DNK... Ovaj pristup se koristi u metodi molekularnog kloniranja, što vam omogućuje da dobijete pojedinačne gene i uvedete ih u stanice koje mogu formirati protein kodiran u genu.
Molekularno kloniranje koristi dvije molekule DNK - umetak koji sadrži gen od interesa, i vektor- DNK služi kao nosač. Uložak se "ušije" u vektor pomoću enzima kako bi se dobila nova, rekombinantna molekula DNA, zatim se ta molekula unosi u stanice domaćina i te stanice formiraju kolonije na hranjivom mediju. Kolonija je potomak jedne stanice, odnosno klon, sve stanice u koloniji su genetski identične i sadrže istu rekombinantnu DNK. Otuda i pojam "molekularno kloniranje", odnosno dobivanje klona stanica koji sadrži fragment DNA koji nas zanima. Nakon što se dobiju kolonije koje sadrže umetak koji nas zanima, moguće je ovaj umetak karakterizirati različitim metodama, na primjer, odrediti njegov točan slijed. Stanice također mogu proizvesti protein kodiran umetkom ako sadrži funkcionalni gen.
Kada se rekombinantna molekula unese u stanice, dolazi do genetske transformacije tih stanica. Transformacija- proces apsorpcije stanice organizma slobodne molekule DNA iz okoliša i njezino ugrađivanje u genom, što dovodi do pojave u takvoj stanici novih nasljednih osobina karakterističnih za organizam donora DNK. Na primjer, ako umetnuta molekula sadrži gen za otpornost na antibiotik ampicilin, tada će transformirane bakterije rasti u njegovoj prisutnosti. Prije transformacije, ampicilin je izazvao njihovu smrt, odnosno pojavila se nova osobina u transformiranim stanicama.
Vektor mora imati nekoliko svojstava:
Prvo, radi se o relativno maloj molekuli DNK kojom se lako manipulira.
Drugo, da bi se DNK očuvala i razmnožila u stanici, ona mora sadržavati određenu sekvencu koja osigurava njezinu replikaciju (podrijetlo replikacije, odnosno ishodište replikacije).
Treće, mora sadržavati genski biljeg, što osigurava odabir samo onih stanica u koje je vektor pao. Obično su to geni otpornosti na antibiotike – tada, u prisutnosti antibiotika, sve stanice koje ne sadrže vektor umiru.
Kloniranje gena najčešće se provodi u bakterijskim stanicama, jer ih je lako uzgajati i brzo se razmnožavaju. Bakterijska stanica obično sadrži jednu veliku kružnu molekulu DNA, dugu nekoliko milijuna parova nukleotida, koja sadrži sve gene potrebne za bakterije – bakterijski kromosom. Osim nje, u nekim bakterijama postoji mala (nekoliko tisuća parova baza) kružna DNK tzv plazmidi(sl. 2). Oni, kao i glavna DNK, sadrže slijed nukleotida koji osiguravaju sposobnost DNK da se replicira (ori). Plazmidi se repliciraju neovisno o glavnoj (kromosomskoj) DNK, stoga su prisutni u stanici u velikom broju kopija. Mnogi od ovih plazmida nose gene otpornosti na antibiotike kako bi razlikovali stanice koje nose plazmid od normalnih stanica. Češće se koriste plazmidi koji nose dva gena koji pružaju otpornost na dva antibiotika, na primjer, tetraciklin i amicilin. Postoje jednostavne metode za izolaciju takvih plazmidnih DNA slobodnih od DNK bakterijskog glavnog kromosoma.
Prijenos gena iz jednog organizma u drugi naziva se transgeneza i takvi modificirani organizmi - transgenski... Prijenosom gena u stanice mikroorganizama dobivaju se rekombinantni proteinski pripravci za potrebe medicine, a posebno humani proteini koji ne izazivaju imunološko odbacivanje - interferoni, inzulin i drugi proteinski hormoni, stanični faktori rasta, kao i proteini za proizvodnju cjepiva. U složenijim slučajevima, kada se modifikacija proteina odvija ispravno samo u eukariotskim stanicama, koriste se transgene stanične kulture ili transgene životinje, posebice stoka (prvenstveno koze), koja izlučuje potrebne proteine u mlijeko, ili se proteini izoliraju iz njihove krvi. . Tako se dobivaju antitijela, faktori zgrušavanja i drugi proteini. Metodom transgeneze dobivaju se usjevne biljke koje su otporne na herbicide i štetnike te imaju druga korisna svojstva. Uz pomoć transgenih mikroorganizama pročišćavaju otpadne vode i bore se protiv onečišćenja, čak postoje i transgeni mikrobi koji mogu razgraditi naftu. Osim toga, transgene tehnologije su nezamjenjive u znanstvenim istraživanjima – razvoj biologije danas je nezamisliv bez rutinske uporabe metoda modifikacije i prijenosa gena.
tehnologija molekularnog kloniranja
Za dobivanje pojedinačnog gena iz bilo kojeg organizma, sva kromosomska DNA se izolira iz njega i cijepa s jednim ili dva restrikcijska enzima. Enzimi su odabrani tako da ne režu gen koji nas zanima, već prave lomove duž njegovih rubova i naprave 1 prekid u plazmidnoj DNK u jednom od gena otpornosti, na primjer, na ampicilin.
Proces molekularnog kloniranja uključuje sljedeće korake:
Rezanje i šivanje - konstrukcija jedne rekombinantne molekule od umetka i vektora.
Transformacija je uvođenje rekombinantne molekule u stanice.
Odabir - odabir stanica koje su primile umetnuti vektor.
Plazmidna DNA se tretira istim restrikcijskim enzimima, a pretvara se u linearnu molekulu ako se odabere takav restrikcijski enzim koji unosi 1 prazninu u plazmid. Kao rezultat toga, krajevi svih nastalih fragmenata DNK završavaju s istim ljepljivim krajevima. Kada se temperatura snizi, ovi krajevi se nasumično povezuju i ligiraju s DNA ligazom (vidi sliku 3).
Dobiva se mješavina kružnih DNK različitog sastava: neke od njih će sadržavati specifičan DNA slijed kromosomske DNK povezane s bakterijskom DNK, druge - fragmente kromosomske DNK povezane zajedno, a treće - reducirani kružni plazmid ili njegov dimer (sl. . 4).
Zatim se provodi ova smjesa genetska transformacija bakterije koje ne sadrže plazmide. Transformacija- proces apsorpcije stanice organizma slobodne molekule DNA iz okoliša i njezino ugrađivanje u genom, što dovodi do pojave u takvoj stanici novih nasljednih osobina karakterističnih za organizam donora DNK. Samo jedan plazmid može ući i razmnožavati se u svakoj stanici. Takve se stanice stavljaju na čvrsti hranjivi medij koji sadrži antibiotik tetraciklin. Stanice koje nisu dobile plazmid neće rasti na ovom mediju, a stanice koje nose plazmid formiraju kolonije od kojih svaka sadrži potomke samo jedne stanice, t.j. sve stanice u koloniji nose isti plazmid (vidi sliku 5).
Dalje, zadatak je odabrati samo stanice u koje je pao vektor s umetkom i razlikovati ih od stanica koje nose samo vektor bez umetanja ili ga uopće ne nose. Taj proces odabira željenih ćelija naziva se rasplod... Za to koristite selektivni markeri- obično geni otpornosti na antibiotike u vektoru, i selektivni mediji koji sadrže antibiotike ili druge tvari koje osiguravaju selekciju.
U našem primjeru, stanice iz kolonija uzgojenih u prisutnosti ampicilina su subkulturirane u dva medija: prvi sadrži ampicilin, a drugi tetraciklin. Kolonije koje sadrže samo plazmid će rasti na oba medija, dok kolonije koje sadrže umetnutu kromosomsku DNA u plazmidima neće rasti na mediju s tetraciklinom (slika 5). Među njima se posebnim metodama odabiru oni koji sadrže gen koji nas zanima, uzgajaju u dovoljnim količinama i izoliraju plazmidnu DNA. Iz njega se, korištenjem istih restrikcijskih enzima koji su korišteni za dobivanje rekombinantne DNA, izrezuje pojedinačni gen od interesa. DNK ovog gena može se koristiti za određivanje slijeda nukleotida, za uvođenje u organizam kako bi se dobila nova svojstva ili za sintetizaciju željenog proteina. Ova metoda izolacije gena tzv molekularno kloniranje.
Vrlo je prikladno koristiti fluorescentne proteine kao marker gene u studijama eukariotskih organizama. Gen prvog fluorescentnog proteina, zeleni fluorescentni protein (GFP) je izoliran iz meduze Aqeuorea victoria i uveden u različite modele organizama (vidi sliku 6). Godine 2008. O. Shimomura, M. Chalfi i R. Tsien dobili su Nobelovu nagradu za otkriće i korištenje ovog proteina.
Tada su izolirani geni drugih fluorescentnih proteina - crvene, plave, žute. Ovi geni su umjetno modificirani za proizvodnju proteina sa željenim svojstvima. Raznolikost fluorescentnih proteina prikazana je na Sl. 7, koja prikazuje Petrijevu zdjelicu s bakterijama koje sadrže gene za različite fluorescentne proteine.
primjena fluorescentnih proteina
Gen fluorescentnog proteina može se povezati s genom bilo kojeg drugog proteina, tada će se tijekom translacije formirati jedan protein - translacijski fuzijski protein, ili fuzije(fuzijski protein) koji fluorescira. Tako je moguće proučavati, na primjer, lokalizaciju (lokaciju) bilo kojeg proteina od interesa u stanici, njihovo kretanje. Ekspresijom fluorescentnih proteina samo u određenim tipovima stanica, moguće je označiti stanice ovih vrsta u višestaničnom organizmu (vidi sliku 8 - mišji mozak, u kojem pojedini neuroni imaju različite boje zbog određene kombinacije gena fluorescentnog proteini). Fluorescentni proteini su nezamjenjiv alat u modernoj molekularnoj biologiji.
Druga metoda dobivanja gena tzv lančana reakcija polimeraze (PCR)... Temelji se na sposobnosti DNA polimeraza da dovrše drugi lanac DNK duž komplementarnog lanca, kao što se to događa u stanicama tijekom replikacije DNA.
Podrijetlo replikacije u ovoj metodi definirano je s dva mala dijela DNK tzv sjemenke, ili temeljni premazi... Ti su početnici komplementarni krajevima gena od interesa na dva lanca DNA. Prvo se kromosomska DNK, iz koje se gen mora izolirati, pomiješa sa sjemenkama i zagrije na 99 ° C. To dovodi do pucanja vodikovih veza i divergencije lanaca DNK. Nakon toga se temperatura spušta na 50-70 ° C (ovisno o duljini i redoslijedu sjemena). U tim uvjetima, početnici se vežu za komplementarne regije kromosomske DNA, tvoreći pravilnu dvostruku spiralu (vidi sliku 9). Nakon toga se dodaje mješavina sva četiri nukleotida potrebna za sintezu DNA i DNA polimeraze. Enzim produljuje prajmere izgradnjom dvolančane DNA odakle su prajmeri pričvršćeni, t.j. od krajeva gena do kraja jednolančane kromosomske molekule. 
Ako se smjesa sada ponovno zagrije, kromosomski i novosintetizirani lanci će se raspršiti. Nakon hlađenja, ponovno će im se pridružiti sjemenke koje se uzimaju u velikom višku (vidi sliku 10).
Na novosintetiziranim lancima oni će se vezati ne na kraj s kojeg je započela prva sinteza, već na suprotni kraj, budući da su lanci DNA antiparalelni. Stoga će u drugom ciklusu sinteze na takvim lancima biti dovršen samo slijed koji odgovara genu (vidi sliku 11).
Ova metoda koristi DNA polimerazu iz termofilnih bakterija, sposobnu izdržati vrenje i djelovati na temperaturama od 70-80°C, ne treba je dodavati svaki put, ali je dovoljno dodati na početku pokusa. Ponavljanjem postupaka zagrijavanja i hlađenja u istom slijedu, možemo u svakom ciklusu udvostručiti broj sekvenci ograničenih na oba kraja ubrizganim sjemenkama (vidi sliku 12).
Nakon otprilike 25 takvih ciklusa, broj kopija gena povećat će se više od milijun puta. Takve se količine lako mogu odvojiti od kromosomske DNK unesene u epruvetu i upotrijebiti u različite svrhe.
Drugo važno postignuće je razvoj metoda za određivanje slijeda nukleotida u DNK - DNK sekvenciranje(iz engleskog niza - sekvenca). Za to je potrebno dobiti gene čiste iz druge DNK jednom od opisanih metoda. Zatim se lančići DNA odvajaju zagrijavanjem i dodaje im se prajmer obilježen radioaktivnim fosforom ili fluorescentnom oznakom. Imajte na umu da se uzima jedno sjeme, komplementarno s jednom niti. Zatim se dodaju DNA polimeraza i smjesa od 4 nukleotida. Takva se smjesa podijeli na 4 dijela i svakome se doda jedan od nukleotida, modificiran tako da ne sadrži hidroksilnu skupinu na trećem atomu deoksiriboze. Ako je takav nukleotid uključen u sintetizirani lanac DNK, tada se njegovo produljenje neće moći nastaviti, jer polimeraza neće imati kamo pričvrstiti sljedeći nukleotid. Stoga se sinteza DNA prekida nakon uključivanja takvog nukleotida. Takvih nukleotida, zvanih dideoksinukleotidi, dodaje se mnogo manje od običnih, pa se završetak lanca događa samo povremeno i u svakom lancu na različitim mjestima. Rezultat je mješavina lanaca različitih duljina, s istim nukleotidom na kraju svakog. Dakle, duljina lanca odgovara broju nukleotida u proučavanom nizu, na primjer, ako smo imali adenil dideoksinukleotid, a rezultirajući lanci bili su dugi 2, 7 i 12 nukleotida, tada je u drugom genu bio adenin, sedmo i dvanaesto mjesto. Dobivena smjesa lanaca može se lako odvojiti po veličini pomoću elektroforeze, a sintetizirani lanci se mogu identificirati radioaktivnošću na rendgenskom filmu (vidi sliku 10).
Ispada da je slika prikazana na dnu slike, nazvana radio autogram. Krećući se po njoj odozdo prema gore i čitajući slovo iznad stupaca svake zone, dobivamo nukleotidni slijed prikazan na slici desno od autograma. Pokazalo se da sintezu ne zaustavljaju samo dideoksinukleotidi, nego i nukleotidi u kojima je neka kemijska skupina, na primjer, fluorescentna boja, vezana na treću poziciju šećera. Ako je svaki nukleotid označen svojom bojom, tada će zone dobivene tijekom odvajanja sintetiziranih lanaca svijetliti različitim svjetlom. To omogućuje da se reakcija provede u jednoj epruveti istovremeno za sve nukleotide i dijeljenjem dobivenih lanaca po duljini, nukleotidi se identificiraju po boji (vidi sliku 11).
Takve su metode omogućile određivanje sekvenci ne samo pojedinačnih gena, već i čitanje cijelih genoma. Sada su razvijene još brže metode za određivanje sekvenci nukleotida u genima. Ako je ljudski genom para dešifrirao veliki međunarodni konzorcij prvom citiranom metodom za 12 godina, drugom, drugom, za tri godine, sada se to može učiniti za mjesec dana. To omogućuje predvidjeti sklonost osobe mnogim bolestima i unaprijed poduzeti mjere za njihovo izbjegavanje.
Razvoj biokemije, biofizike, genetike, citokemije, mnogih grana mikrobiologije i virologije oko početka 40-ih godina XX. stoljeća. približio ga proučavanju životnih pojava na molekularnoj razini. Uspjesi ovih znanosti, istovremeno i s različitih strana, doveli su do spoznaje da upravo na molekularnoj razini funkcioniraju glavni kontrolni sustavi tijela i da će daljnji napredak ovih znanosti ovisiti o razotkrivanju biološke funkcije molekula koje čine tijelo organizama, njihovo sudjelovanje u sintezi i raspadu, međusobne transformacije i reprodukciju spojeva u stanici, kao i razmjena energije i informacija koja se pri tome događa. Dakle, na spoju ovih bioloških disciplina s kemijom i fizikom nastala je potpuno nova grana - molekularna biologija.
Za razliku od biokemije, pažnja suvremene molekularne biologije uglavnom je usmjerena na proučavanje strukture i funkcije najvažnijih klasa biopolimera - proteina i nukleinskih kiselina, od kojih prvi određuju samu mogućnost metaboličkih reakcija, a drugi - biosinteza specifičnih proteina. Stoga je jasno da je nemoguće povući jasnu razliku između molekularne biologije i biokemije, odgovarajućih odjeljaka genetike, mikrobiologije i virologije.
Pojava molekularne biologije bila je usko povezana s razvojem novih istraživačkih metoda, o kojima je već bilo riječi u relevantnim poglavljima. Uz razvoj elektronske mikroskopije i drugih metoda mikroskopske tehnologije, važnu ulogu imale su metode frakcioniranja staničnih elemenata razvijene 50-ih godina. Temeljile su se na poboljšanim metodama diferencijalnog centrifugiranja (A. Claude, 1954.). U to vrijeme već su postojale prilično pouzdane metode za izolaciju i frakcioniranje biopolimera. To uključuje, posebice, metodu koju je predložio A. Tiselius (1937; Nobelova nagrada, 1948) za frakcioniranje proteina pomoću elektroforeze, metode za izolaciju i pročišćavanje nukleinskih kiselina (E. Key, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky, itd.). Paralelno, u mnogim laboratorijima diljem svijeta razvijene su različite metode kromatografske analize (A. Martin i R. Sing, 1941; Nobelova nagrada, 1952), koje su naknadno značajno poboljšane.
Rentgenska strukturna analiza odigrala je neprocjenjivu uslugu u dekodiranju strukture biopolimera. Temeljna načela rendgenske strukturne analize razvila je na King's Collegeu, Sveučilište u Londonu pod vodstvom W. Bragga od strane grupe istraživača, među kojima su bili J. Bernal, A. Lonsdale, W. Astbury, J. Robertson i drugi.
Posebno treba istaknuti studije profesora Moskovskog državnog sveučilišta A. R. Kizela o biokemiji protoplazme (1925. - 1929.), koje su bile od velike važnosti za kasniji razvoj molekularne biologije. Kizel je ušao u duboko ukorijenjenu ideju da u srcu svake protoplazme leži posebno proteinsko tijelo - ploče, koje navodno određuju sve njegove najvažnije strukturne i funkcionalne značajke. Pokazao je da su ploče protein koji se nalazi samo u miksomicetama, i to u određenoj fazi razvoja, te da u protoplazmi ne postoji stalna komponenta – jedan protein skeleta. Tako je proučavanje problema strukture protoplazme i funkcionalne uloge proteina krenulo pravim putem i dobilo prostor za njegov razvoj. Kieselovo istraživanje je dobilo svjetsko priznanje, potaknuvši proučavanje kemije sastavnih dijelova stanice.
Pojam "molekularna biologija", koji je prvi upotrijebio engleski kristalograf sa Sveučilišta u Leedsu, W. Astbury, pojavio se vjerojatno početkom 1940-ih (prije 1945.). Temeljne rendgenske strukturne studije proteina i DNK, koje je proveo Astbury 1930-ih, poslužile su kao osnova za kasnije uspješno dešifriranje sekundarne strukture ovih biopolimera. Godine 1963. J. Bernal je napisao: "Spomenik će mu podići sva molekularna biologija - znanost koju je on nazvao i zapravo osnovao" *. analiza organskih i fibrilarnih spojeva ", objavljena u engleskom časopisu "Nature"** . Astbury (1950) je u svom Harveyjevom predavanju zabilježio: "Zadovoljan sam što se sada termin molekularna biologija već široko koristi, iako je malo vjerojatno da sam ga ja prvi predložio. Svidio mi se i dugo sam ga pokušavao širiti." Već 1950. Astbury je bio jasan da se molekularna biologija bavi prvenstveno strukturom i konformacijom makromolekula, čije je proučavanje ključno za razumijevanje funkcioniranja živih organizama.
* (Biogr. Mem. Momci Roy. Soc, 1963, v. 9, 29.)
** (W. T. Astbury. Napredak rendgenske analize organskih i vlaknastih struktura.- Priroda ,. 1946., v. 157, 121.)
*** (W. T. Astbury. Avanture u molekularnoj biologiji. Thomas Springfield, 1952., str. 3.)
Molekularna biologija bila je i stoji pred, zapravo, istim zadaćama kao i za svu biologiju u cjelini - spoznaju suštine života i njegovih temeljnih pojava, posebice, kao što su nasljeđe i varijabilnost. Suvremena molekularna biologija prvenstveno je namijenjena dešifriranju strukture i funkcije gena, načina i mehanizama realizacije genetske informacije organizama u različitim fazama ontogeneze i u različitim fazama njezina čitanja. Osmišljen je da otkrije suptilne mehanizme regulacije aktivnosti gena i diferencijacije stanica, da razjasni prirodu mutageneze i molekularne osnove evolucijskog procesa.
Sljedeća otkrića bila su od najveće važnosti za razvoj molekularne biologije. Godine 1944. američki istraživači O. Avery, K. McLeod (Nobelova nagrada, 1923.) i M. McCarthy pokazali su da molekule DNA izolirane iz pneumokoka imaju transformirajuću aktivnost. Nakon hidrolize ovih DNA deoksiribonukleazom, njihova transformirajuća aktivnost potpuno je nestala. Tako je prvi put uvjerljivo dokazano da je DNK, a ne protein, taj koji ima genetske funkcije u stanici.
Pošteno radi, treba napomenuti da je fenomen bakterijske transformacije otkriven mnogo ranije od otkrića Averyja, McLeoda i McCarthyja. Godine 1928. F. Griffith je objavio članak u kojem je izvijestio da nakon dodavanja ubijenih stanica inkapsuliranog virulentnog soja u nevirulentne (nekapsulirane) pneumokoke, dobivena mješavina stanica postaje fatalna za miševe. Štoviše, žive stanice pneumokoka izolirane od životinja zaraženih ovom smjesom već su bile virulentne i imale su polisaharidnu kapsulu. Tako se u ovom pokusu pokazalo da se pod utjecajem nekih komponenti ubijenih pneumokoknih stanica nekapsulirani oblik bakterije pretvara u virulentni oblik koji tvori kapsule. 16 godina kasnije, Avery, McLeod i McCarthy zamijenili su ubijene cijele pneumokokne stanice u ovom eksperimentu svojom deoksiribonukleinskom kiselinom i pokazali da je DNK ta koja ima transformirajuću aktivnost (vidi također poglavlja 7 i 25). Značaj ovog otkrića teško se može precijeniti. Potaknuo je proučavanje nukleinskih kiselina u mnogim laboratorijima diljem svijeta i natjerao znanstvenike da se usredotoče na DNK.
Zajedno s otkrićem Averyja, McLeoda i McCarthyja, početkom 50-ih godina već se nakupila prilično velika količina izravnih i neizravnih dokaza da nukleinske kiseline imaju isključivu ulogu u životu i imaju genetsku funkciju. Na to je posebno ukazivala priroda lokalizacije DNA u stanici i podaci R. Vendrelija (1948.) da je sadržaj DNK po stanici strogo konstantan i korelira sa stupnjem ploidnosti: u haploidnim zametnim stanicama, DNK je upola manji u diploidnim somatskim stanicama. U prilog genetskoj ulozi DNK govorila je i njezina izražena metabolička stabilnost. Do početka 50-ih godina nakupilo se mnogo različitih činjenica koje ukazuju da većina poznatih mutagenih čimbenika djeluje uglavnom na nukleinske kiseline, a posebno na DNK (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E Freese, 1957, itd.).
Proučavanje različitih faga i virusa bilo je od posebne važnosti za utvrđivanje genetske uloge nukleinskih kiselina. 1933. D. Schlesinger je pronašao DNK u bakteriofagu Escherichia coli. Otkako je W. Stanley (1935., Nobelova nagrada, 1946.) izolirao virus mozaika duhana (TMV) u kristalnom stanju, započela je nova faza u proučavanju biljnih virusa. Godine 1937-1938. F. Bowden i N. Peary, zaposlenici Rothamstead Agricultural Station (Engleska), pokazali su da mnogi biljni virusi koje su izolirali nisu globulini, već su ribonukleoproteini i sadrže nukleinsku kiselinu kao esencijalnu komponentu. Na samom početku 40-ih godina objavljeni su radovi G. Schramma (1940), PA Agatova (1941), G. Millera i W. Stanleya (1941), koji ukazuju da primjetna kemijska modifikacija proteinske komponente ne dovodi do gubitka infektivnosti TMV-a. To je ukazivalo da proteinska komponenta ne može biti nositelj nasljednih svojstava virusa, kao što su mnogi mikrobiolozi i dalje vjerovali. Uvjerljive dokaze u prilog genetskoj ulozi nukleinske kiseline (RNA) u biljnim virusima dobili su 1956. G. Schramm u Tübingenu (Njemačka) i H. Frenkel-Konrath u Kaliforniji (SAD). Ovi istraživači su gotovo istovremeno i neovisno jedan o drugom izolirali RNA iz TMV-a i pokazali da upravo ona, a ne protein, posjeduje infektivnost: kao rezultat infekcije biljaka duhana ovom RNA, u njima su se formirale i umnožavale normalne virusne čestice. . To je značilo da RNA sadrži informacije za sintezu i sastavljanje svih virusnih komponenti, uključujući virusni protein. I. G. Atabekov je 1968. ustanovio da protein igra bitnu ulogu u samoj infekciji biljaka – priroda proteina određuje spektar biljaka domaćina.
Godine 1957. Frenkel-Konrat je po prvi put izvršio rekonstrukciju TMV-a od njegovih sastavnih komponenti - RNA i proteina. Uz normalne čestice dobio je mješovite "hibride" u kojima je RNA bila iz jednog soja, a protein iz drugog. Nasljednost takvih hibrida u potpunosti je određena RNA, a potomci virusa pripadali su soju čija je RNA korištena za dobivanje originalnih miješanih čestica. Kasnije su eksperimenti A. Girera, G. Schustera i G. Schramma (1958) i G. Vitmana (1960 - 1966) pokazali da kemijska modifikacija komponente TMV nukleinske kiseline dovodi do pojave raznih mutanata ovog virusa.
Godine 1970. D. Baltimore i G. Temin ustanovili su da se prijenos genetske informacije može dogoditi ne samo s DNK na RNA, već i obrnuto. Oni su u nekim onkogenim virusima koji sadrže RNA (onkornavirusi) pronašli poseban enzim, takozvanu reverznu transkriptazu, koja je sposobna komplementarno sintetizirati DNK na lancima RNA. Ovo veliko otkriće omogućilo je razumijevanje mehanizma umetanja genetskih informacija virusa koji sadrže RNA u genom domaćina i novi pogled na prirodu njihovog onkogenog djelovanja.
Pojam nukleinske kiseline uveo je njemački biokemičar R. Altmann 1889. godine, nakon što je te spojeve 1869. otkrio švicarski liječnik F. Miescher. Miescher je nekoliko tjedana ekstrahirao gnojne stanice razrijeđenom klorovodičnom kiselinom i u ostatku dobio gotovo čisti nuklearni materijal. Ovaj materijal je smatrao karakterističnom "tvarom staničnih jezgri i nazvao ga nukleinom. Po svojim se svojstvima nuklein oštro razlikovao od proteina: bio je kiseliji, nije sadržavao sumpor, ali je sadržavao puno fosfora, bio je dobro topiv u lužinama , ali se nije otopio u razrijeđenim kiselinama.
Misher je rezultate svojih opažanja nukleina poslao F. Hoppe-Seileru za objavu u časopisu. Supstanca koju je opisao bila je toliko neobična (u to vrijeme od svih bioloških spojeva koji su sadržavali fosfor bio je poznat samo lecitin) da Hoppe-Seiler nije povjerovao Mischerovim pokusima, vratio mu je rukopis i dao upute svojim kolegama N. Ploshu i N. Lyubavin da provjeri svoje zaključke na drugom materijalu ... Misherovo djelo "O kemijskom sastavu gnojnih stanica" objavljeno je dvije godine kasnije (1871.). Istodobno su objavljeni radovi Hoppe-Seilera i njegovih suradnika o sastavu gnojnih stanica, eritrocita ptica, zmija i drugih stanica. Tijekom sljedeće tri godine nuklein je izoliran iz životinjskih stanica i kvasca.
Misher je u svom radu primijetio da detaljna studija različitih nukleina može dovesti do uspostavljanja razlika među njima, anticipirajući na taj način ideju specifičnosti nukleinskih kiselina. Istražujući mlijeko od lososa, Miescher je otkrio da je nuklein u obliku soli i da je povezan s osnovnim proteinom, koji je nazvao protamin.
Godine 1879. A. Kossel je počeo proučavati nuklein u laboratoriju Hoppe-Seilera. Godine 1881. izolirao je hipoksantin iz nukleina, ali je tada još sumnjao u podrijetlo te baze i vjerovao da bi hipoksantin mogao biti produkt razgradnje proteina. Godine 1891. Kossel je među proizvodima hidrolize nukleina otkrio adenin, gvanin, fosfornu kiselinu i još jednu tvar sa svojstvima šećera. Za svoja istraživanja o kemiji nukleinskih kiselina Kossel je 1910. godine dobio Nobelovu nagradu.
Daljnji napredak u dešifriranju strukture nukleinskih kiselina povezan je s istraživanjem P. Levina i kolega (1911. - 1934.). 1911. P. Levin i V. Jacobs identificirali su ugljikohidratnu komponentu adenozina i guanozina; otkrili su da je D-riboza dio ovih nukleozida. Godine 1930. Levin je pokazao da je ugljikohidratna komponenta deoksiribonukleozida 2-deoksi-D-riboza. Iz njegovih radova postalo je poznato da se nukleinske kiseline grade od nukleotida, tj. fosforiliranih nukleozida. Levin je vjerovao da je glavna vrsta veze u nukleinskim kiselinama (RNA) 2 ", 5" -fosfodiesterska veza. Ovaj stav se pokazao pogrešnim. Zahvaljujući radu engleskog kemičara A. Todda (Nobelova nagrada, 1957.) i njegovih suradnika, kao i engleskih biokemičara R. Markhama i J. Smitha, početkom 50-ih postalo je poznato da je glavna vrsta veze u RNK je 3 ", 5" - fosfodiesterska veza.
Levin je pokazao da se različite nukleinske kiseline mogu razlikovati u prirodi komponente ugljikohidrata: neke od njih sadrže šećer deoksiribozu, dok druge sadrže ribozu. Osim toga, ove dvije vrste nukleinskih kiselina razlikovale su se po prirodi jedne od baza: nukleinske kiseline tipa pentoze sadržavale su uracil, a nukleinske kiseline tipa deoksipentoze timin. Deoksipentozna nukleinska kiselina (u modernoj terminologiji, deoksiribonukleinska kiselina - DNK) obično se lako izolirala u velikim količinama iz timusa (timusne žlijezde) teladi. Stoga se naziva timonukleinska kiselina. Izvor nukleinske kiseline (RNA) tipa pentoze uglavnom su bili kvasac i pšenične klice. Ovaj tip se često naziva nukleinska kiselina kvasca.
Početkom tridesetih godina prošlog stoljeća prilično se čvrsto ukorijenila ideja da je nukleinska kiselina tipa kvasca karakteristična za biljne stanice, a da je timonukleinska kiselina karakteristična samo za jezgre životinjskih stanica. Dvije vrste nukleinskih kiselina - RNA i DNA - nazvane su biljne i životinjske nukleinske kiseline. Međutim, kao što pokazuju rane studije A. N. Belozerskog, takva podjela nukleinskih kiselina nije opravdana. Godine 1934. Belozersky je prvi otkrio timonukleinsku kiselinu u biljnim stanicama: iz sadnica graška izolirao je i identificirao timin-pirimidinsku bazu, karakterističnu za DNK. Zatim je otkrio timin u drugim biljkama (sjeme soje, grah). Godine 1936. A. N. Belozersky i I. I. Dubrovskaya izolirali su preparativnu DNK iz sadnica divljeg kestena. Osim toga, niz radova koje su u Engleskoj 1940-ih proveli D. Davidson i njegovi kolege uvjerljivo je pokazao da se biljna nukleinska kiselina (RNA) nalazi u mnogim životinjskim stanicama.
Široka uporaba citokemijske reakcije na DNK i reakcije J. Bracheta (1944.) na RNA, koju su razvili R. Felgen i G. Rosenbeck (1924.), omogućila je prilično brzo i nedvosmisleno rješavanje pitanja prevladavajuće lokalizacije. ovih nukleinskih kiselina u stanici. Pokazalo se da je DNA koncentrirana u jezgri, dok je RNA uglavnom koncentrirana u citoplazmi. Kasnije je otkriveno da se RNA nalazi i u citoplazmi i u jezgri, a osim toga identificirana je i citoplazmatska DNK.
Što se pitanja primarne strukture nukleinskih kiselina tiče, sredinom 40-ih godina prošlog stoljeća u znanosti se čvrsto ustalila ideja P. Levina prema kojoj su sve nukleinske kiseline građene po istom tipu i sastoje se od istih tzv. -nazvani tetranukleotidni blokovi. Svaki od ovih blokova, prema Levinu, sadrži četiri različita nukleotida. Tetranukleotidna teorija strukture nukleinskih kiselina ovim je biopolimerima u velikoj mjeri oduzela specifičnost. Stoga ne čudi što se sva specifičnost živih bića u to vrijeme povezivala samo s proteinima čija je priroda monomera mnogo raznolikija (20 aminokiselina).
Prvu prazninu u teoriji tetranukleotidne strukture nukleinskih kiselina napravili su analitički podaci engleskog kemičara J. Gulanda (1945. - 1947.). Pri određivanju sastava nukleinskih kiselina po dušiku baza nije dobio ekvimolarni omjer baza, kao što bi trebao biti prema Levinovoj teoriji. Konačno, tetranukleotidna teorija strukture nukleinskih kiselina propala je kao rezultat istraživanja E. Chargaffa i njegovih suradnika (1949. - 1951.). Za odvajanje baza koje su odcijepljene od DNA kao rezultat kisele hidrolize, Chargaff je koristio papirnu kromatografiju. Svaka od ovih baza precizno je određena spektrofotometrijski. Chargaff je uočio značajna odstupanja od ekvimolarnog baznog omjera u DNK različitog podrijetla i po prvi put definitivno ustvrdio da DNK ima izraženu vrstu specifičnosti. Time je okončana hegemonija koncepta specifičnosti proteina u živoj stanici. Analizirajući DNK različitog podrijetla, Chargaff je otkrio i formulirao jedinstvene obrasce sastava DNK, koji su u znanost ušli pod imenom Chargaffova pravila. Prema ovim pravilima, u svim DNK, bez obzira na porijeklo, količina adenina jednaka je količini timina (A = T), količina guanina jednaka je količini citozina (G = C), količini purina jednaka je količini pirimidina (G + A = C + T), količina baza sa 6-amino skupinama jednaka je broju baza sa 6-keto skupinama (A + C = G + T). Istodobno, unatoč tako strogim kvantitativnim podudarnostima, DNK različitih vrsta razlikuju se u vrijednosti omjera A + T: G + C. U nekim DNK količina gvanina i citozina prevladava nad količinom adenina i timina (Chargaff je te DNK nazvao DNK tipa GC); druge DNK sadržavale su više adenina i timina od guanina i citozina (ti su se DNK nazivali DNK tipa AT). Podaci o sastavu DNK koje je dobio Chargaff imali su iznimnu ulogu u molekularnoj biologiji. Oni su činili osnovu za otkriće strukture DNK, koje su 1953. godine napravili J. Watson i F. Crick.
Davne 1938. W. Astbury i F. Bell, koristeći analizu difrakcije rendgenskih zraka, pokazali su da osnovne ravnine u DNK trebaju biti okomite na dugu os molekule i nalikovati, takoreći, hrpu ploča koja leži jedna iznad drugi. Usavršavanjem tehnike rendgenske strukturne analize do 1952.-1953. nakupile su se informacije koje su omogućile prosuđivanje duljine pojedinih veza i kutova nagiba. To je omogućilo s najvećom vjerojatnošću da se predstavi priroda orijentacije prstenova pentoznih ostataka u šećerno-fosfatnoj okosnici molekule DNA. Godine 1952. S. Farberg je predložio dva spekulativna modela DNK, koji su predstavljali jednolančanu molekulu presavijenu ili uvrnutu na samu sebe. Jednako spekulativni model strukture DNK predložili su 1953. L. Pauling (nobelovac, 1954.) i R. Corey. U ovom modelu, tri upletena DNK lanca formirala su dugu spiralu, čiju jezgru su predstavljale fosfatne skupine, a baze su se nalazile izvan nje. Do 1953. M. Wilkins i R. Franklin dobili su jasnije uzorke difrakcije X-zraka DNK. Njihova analiza pokazala je potpunu nedosljednost modela Farberg, Pauling i Corey. Koristeći Chargaffove podatke, uspoređujući različite kombinacije molekularnih modela pojedinačnih monomera i podatke rendgenske strukturne analize, J. Watson i F. Crick su 1953. godine došli do zaključka da molekula DNA mora biti dvolančana spirala. Chargaffova pravila oštro su ograničila broj mogućih uređenih kombinacija baza u predloženom DNK modelu; sugerirali su Watsonu i Cricku da molekula DNA mora imati specifično uparivanje baza - adenin s timinom i gvanin s citozinom. Drugim riječima, adenin u jednom lancu DNA uvijek striktno odgovara timinu u drugom lancu, a gvanin u jednom lancu nužno odgovara citozinu u drugom. Tako su Watson i Crick prvi formulirali iznimno važno načelo komplementarne strukture DNK, prema kojem jedan lanac DNK nadopunjuje drugi, tj. bazni slijed jednog lanca jednoznačno određuje bazni slijed u drugom (komplementarnom) lancu. . Postalo je očito da sama struktura DNK sadrži potencijal za njezinu točnu reprodukciju. Ovaj model strukture DNK danas je općeprihvaćen. Crick, Watson i Wilkins dobili su Nobelovu nagradu 1962. za dešifriranje strukture DNK.
Treba napomenuti da je ideja o mehanizmu za točnu reprodukciju makromolekula i prijenos nasljednih informacija nastala u našoj zemlji. Godine 1927. N, K. Koltsov sugerirao je da se tijekom umnožavanja stanica reprodukcija molekula događa točnom autokatalitičkom reprodukcijom dostupnih roditeljskih molekula. Istina, u to vrijeme Koltsov je ovo svojstvo obdario ne molekulama DNK, već proteinskim molekulama, čiji funkcionalni značaj u to vrijeme nije bio poznat. Ipak, sama ideja autokatalitičke reprodukcije makromolekula i mehanizam prijenosa nasljednih svojstava pokazala se proročkom: postala je ideja vodilja moderne molekularne biologije.
A.S.Spirin, G.N. Zaitseva, B.F. Vanyushin, S.O. Uryson, A.S. različiti organizmi u potpunosti su potvrdili obrasce koje je otkrio Chargaff i potpunu usklađenost s molekularnim modelom strukture DNK, koji su predložili Watson i Crick. Ova istraživanja su pokazala da DNK različitih bakterija, gljiva, algi, aktinomiceta, viših biljaka, beskralježnjaka i kralježnjaka ima specifičan sastav. Razlike u sastavu (sadržaj parova AT-baza) posebno su izražene kod mikroorganizama, što je važno taksonomsko obilježje. Kod viših biljaka i životinja varijacije vrsta u sastavu DNK su mnogo manje izražene. Ali to uopće ne znači da je njihov DNK manje specifičan. Osim sastava baza, specifičnost je uvelike određena njihovim slijedom u lancima DNA.
Uz uobičajene baze, u sastavu DNA i RNA pronađene su dodatne dušične baze. Tako je G. White (1950) pronašao 5-metilcitozin u DNK biljaka i životinja, a D. Dunn i J. Smith (1958) su pronašli metilirani adenin u nekoj DNK. Dugo se vremena metilcitozin smatrao posebnom značajkom genetskog materijala viših organizama. Godine 1968. A. N. Belozersky, B. F. Vanyushin i N. A. Kokurina ustanovili su da se može naći i u DNK bakterija.
Godine 1964. M. Gold i J. Hurwitz otkrili su novu klasu enzima koji prirodno modificiraju DNK – njezinu metilaciju. Nakon ovog otkrića postalo je jasno da se manje (sadržane u malim količinama) baze pojavljuju već na gotovom polinukleotidnom DNA lancu kao rezultat specifične metilacije ostataka citozina i adenina u posebnim sekvencama. Konkretno, prema podacima B. F. Vanyushin, Ya. I. Bur'yanov i A. N. Belozersky (1969), metilacija adenina u DNA E. coli može se dogoditi u terminacijskim kodonima. Prema ANBelozerskom i kolegama (1968. - 1970.), kao i M. Meselsonu (SAD) i V. Arberu (Švicarska) (1965. - 1969.), metilacija daje molekulama DNK jedinstvena individualna svojstva i, u kombinaciji s djelovanjem specifičnih nukleaze, dio je složenog mehanizma koji kontrolira sintezu DNA u stanici. Drugim riječima, priroda metilacije određene DNK određuje pitanje može li se ona razmnožavati u danoj stanici.
Gotovo u isto vrijeme započelo je izolacija i intenzivno proučavanje DNA metilaza i restrikcijskih endonukleaza; godine 1969-1975 uspostavljene nukleotidne sekvence koje neki od ovih enzima prepoznaju u DNA (H. Boyer, H. Smith, S. Lynn, K. Murray). Kada se različite DNK hidroliziraju restrikcijskim enzimom, cijepaju se prilično veliki fragmenti s istim ljepljivim krajevima. To omogućuje ne samo analizu strukture gena, kao što se radi u malim virusima (D. Nathans, S. Adler, 1973. - 1975.), već i konstruiranje različitih genoma. S otkrićem ovih specifičnih restrikcijskih enzima, genetski inženjering je postao opipljiva stvarnost. Geni različitog podrijetla umetnuti u male plazmidne DNA već se lako uvode u različite stanice. Tako je dobivena nova vrsta biološki aktivnog plazmida koji daje otpornost na određene antibiotike (S. Cohen, 1973.), ribosomski geni žabe i Drosophile uvedeni su u plazmide E. coli (J. Morrow, 1974.; H. Boyer, D. Hogness, R. Davis, 1974. - 1975.). Tako su otkriveni pravi načini dobivanja temeljno novih organizama uvođenjem i integracijom različitih gena u njihov genski fond. Ovo otkriće može biti usmjereno na dobrobit cijelog čovječanstva.
1952. G. White i S. Cohen otkrili su da DNK T-even faga sadrži neobičnu bazu - 5-hidroksimetilcitozin. Kasnije je iz radova E. Vol'kina i R. Sinsheimera (1954.) i Cohena (1956.) postalo poznato da se ostaci oksimetilcitozina mogu potpuno ili djelomično glukozidizirati, zbog čega je molekula DNA faga zaštićena od hidrolitičkog djelovanja. djelovanje nukleaza.
Početkom 50-ih, iz radova D. Dunna i J. Smitha (Engleska), S. Zamenhofa (SAD) i A. Wackera (Njemačka), postalo je poznato da mnogi umjetni analozi baza mogu biti uključeni u DNK, ponekad zamjenjujući do 50% timina. Obično ove zamjene dovode do pogrešaka u replikaciji, transkripciji i translaciji DNK te do pojave mutanata. Tako je J. Marmur (1962) ustanovio da DNK nekih faga umjesto timina sadrži oksimetiluracil. 1963. I. Takahashi i J. Marmur otkrili su da DNK jednog od faga sadrži uracil umjesto timina. Tako se urušio još jedan princip po kojem su nukleinske kiseline prethodno bile odvojene. Od vremena rada P. Levina vjerovalo se da je obilježje DNK timin, a RNA uracil. Postalo je jasno da ova značajka nije uvijek pouzdana, a temeljna razlika u kemijskoj prirodi dviju vrsta nukleinskih kiselina, kako se čini do danas, je samo priroda komponente ugljikohidrata.
U proučavanju faga otkriveni su mnogi neobični znakovi organizacije nukleinskih kiselina. Od 1953. vjeruje se da su sva DNK dvolančane linearne molekule, a RNA samo jednolančana. Ova situacija je značajno uzdrmana 1961. godine, kada je R. Sinsheimer otkrio da je DNA faga φ X 174 predstavljena jednolančanom kružnom molekulom. Istina, kasnije se pokazalo da u ovom obliku ova DNK postoji samo u vegetativnoj čestici faga, a replikativni oblik DNK ovog faga također je dvolančan. Osim toga, sasvim neočekivano se pokazalo da RNA nekih virusa može biti dvolančana. Ovu novu vrstu makromolekularne organizacije RNA otkrili su 1962. P. Gomatos, I. Tamm i drugi istraživači kod nekih životinjskih virusa i kod virusa tumora rane biljaka. Nedavno su V. I. Agol i A. A. Bogdanov (1970) ustanovili da osim linearnih RNA molekula postoje i zatvorene ili cikličke molekule. Oni su otkrili cikličku dvolančanu RNA, posebno u virusu encefalomijelokarditisa. Zahvaljujući radovima H. Devo, L. Tinoko, T. I. Tikhonenko, E. I. Budovsky i drugi (1960. - 1974.), postale su poznate glavne značajke organizacije (pakiranja) genetskog materijala u bakteriofagima.
Krajem 1950-ih američki znanstvenik P. Doty otkrio je da pri zagrijavanju dolazi do denaturacije DNA, praćene rupturom vodikovih veza između parova baza i divergencijom komplementarnih lanaca. Ovaj proces ima karakter faznog prijelaza "spiral-coil" i nalikuje topljenju kristala. Stoga je Doty proces toplinske denaturacije DNK nazvao taljenjem DNK. Polaganim hlađenjem dolazi do renaturacije molekula, odnosno ponovnog sjedinjavanja komplementarnih polovica.
Princip renaturacije 1960. godine koristili su J. Marmur i K. Shildkraut za određivanje stupnja "hibridizabilnosti" DNK različitih mikroorganizama. Kasnije su E. Bolton i B. McCarthy poboljšali ovu tehniku, predlažući metodu tzv. DNA-agar stupaca. Ova se metoda pokazala kao nezamjenjiva u proučavanju stupnja homologije nukleotidnog slijeda različitih DNA i u rasvjetljavanju genetskog odnosa različitih organizama. Otvorena Doty denaturacija DNA u kombinaciji s kromatografijom koju su opisali J. Mandel i A. Hershey * (1960.) na metiliranom albuminu i centrifugiranjem u gradijentu gustoće (metodu su 1957. razvili M. Meselson, F. Stahl i D. Vinograd) se naširoko koristi za odvajanje, izolaciju i analizu pojedinačnih komplementarnih lanaca DNK Na primjer, V. Shibalski (SAD), koristeći ove tehnike za odvajanje DNK lambda faga, pokazao je 1967.-1969. da su oba faga lanca genetski aktivna. , a ne jedan, kako se to smatralo (S. Spigelman, 1961). Treba napomenuti da je ideju o genetskom značaju oba lanca DNK lambda faga prvi iznio u SSSR-u S.E.Bresler (1961).
* (A. Hershey, zajedno s M. Delbrückom i S. Luria, dobio je Nobelovu nagradu 1969. za svoj rad na genetici bakterija i virusa.)
Određivanje nukleotidnog slijeda DNA od iznimne je važnosti za razumijevanje organizacije i funkcionalne aktivnosti genoma. Potraga za metodama za takvo određivanje provodi se u mnogim laboratorijima diljem svijeta. U Sjedinjenim Državama M. Beer i njegovi kolege pokušavaju uspostaviti slijed DNK pomoću elektronske mikroskopije još od kasnih 1950-ih, ali do sada bezuspješno. Početkom 50-ih, od prvih radova Sinsheimera, Chargaffa i drugih istraživača o enzimskoj razgradnji DNK, postalo je poznato da su različiti nukleotidi u molekuli DNA raspoređeni, iako nekatično, ali neravnomjerno. Prema britanskom kemičaru K. Bartonu (1961.), pirimidini (više od 70% njih) koncentrirani su uglavnom u obliku odgovarajućih blokova. A. L. Mazin i B. F. Vanyushin (1968. - 1969.) ustanovili su da različite DNK imaju različite stupnjeve kohezije pirimidina i da se u DNK životinjskih organizama značajno povećava kako prijelazom s nižeg na više. Dakle, evolucija organizama se odražava u strukturi njihovih genoma. Zato je za razumijevanje evolucijskog procesa u cjelini od posebne važnosti usporedno proučavanje strukture nukleinskih kiselina. Analiza strukture biološki važnih polimera i prije svega DNK iznimno je važna za rješavanje mnogih posebnih pitanja filogenetike i taksonomije.
Zanimljivo je primijetiti da je engleski fiziolog E. Lankester, koji je proučavao hemoglobine mekušaca, anticipirao ideje molekularne biologije prije točno 100 godina, napisao: Kad bismo mogli jasno utvrditi razlike u molekularnoj organizaciji i funkcioniranju organizama, mi bismo bio bi u stanju puno bolje razumjeti podrijetlo i evoluciju različitih organizama nego na temelju morfoloških opažanja"*. Važnost biokemijskih studija za sistematiku istaknuo je i V.L.
* (E. R. Lankester. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen. - "Pfluger" s Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)
** (V. L. Komarov. Izabrana djela, vol. 1. M.-L., Izdavačka kuća Akademije znanosti SSSR-a, 1945., str. 331.)
A. V. Blagoveshchensky i S. L. Ivanov poduzeli su prve korake u našoj zemlji dvadesetih godina 20. stoljeća kako bi razjasnili neka pitanja evolucije i sistematike organizama na temelju usporedne analize njihova biokemijskog sastava (vidi 2. poglavlje). Komparativna analiza strukture proteina i nukleinskih kiselina sada postaje sve opipljivija pomoć taksonomistima (vidi 21. poglavlje). Ova metoda molekularne biologije omogućuje ne samo da se razjasni položaj pojedinih vrsta u sustavu, već nas također tjera da iznova pogledamo sama načela klasifikacije organizama, a ponekad i revidiramo cijeli sustav kao cjelinu, kao npr. dogodilo, na primjer, s taksonomijom mikroorganizama. Bez sumnje, u budućnosti će analiza strukture genoma zauzeti središnje mjesto u kemosistematici organizama.
Dešifriranje mehanizama replikacije i transkripcije DNA bilo je od velike važnosti za razvoj molekularne biologije (vidi 24. poglavlje).
Važan pomak u rješavanju problema biosinteze proteina povezan je s napretkom u proučavanju nukleinskih kiselina. 1941. T. Casperson (Švedska) i 1942. J. Brachet (Belgija) skrenuli su pozornost na činjenicu da tkiva s aktivnom sintezom proteina sadrže povećanu količinu RNA. Zaključili su da ribonukleinske kiseline igraju ključnu ulogu u sintezi proteina. Činilo se da su 1953. E. Gale i D. Fox dobili izravne dokaze o izravnom sudjelovanju RNA u biosintezi proteina: prema njihovim podacima, ribonukleaza je značajno potisnula uključivanje aminokiselina u lizate bakterijskih stanica. Slične podatke dobili su V. Alfrey, M. Delhi i A. Mirsky (1953) o homogenatima jetre. Kasnije je E. Gale odbacio ispravnu od njega izraženu ideju o vodećoj ulozi RNK u sintezi proteina, pogrešno vjerujući da je do aktiviranja sinteze proteina u sustavu bez stanica došlo pod utjecajem neke druge tvari nepoznate prirode. Godine 1954. P. Zamechnik, D. Littlefield, RB Khesin-Lurie i drugi otkrili su da se najaktivnije uključivanje aminokiselina javlja u frakcijama supstaničnih čestica - mikrosomima bogatim RNA. P. Zamechnik i E. Keller (1953. - 1954.) otkrili su da je ugradnja aminokiselina značajno pojačana u prisutnosti frakcije supernatanta u uvjetima regeneracije ATP-a. P. Sikewitz (1952) i M. Hoagland (1956) izolirali su proteinsku frakciju (pH 5 frakcija) iz tekućine supernatanta, koja je bila odgovorna za oštru stimulaciju uključivanja aminokiselina u mikrosome. Uz proteine, u supernatantu je pronađena posebna klasa RNA niske molekularne težine, koje se danas nazivaju transportne RNA (tRNA). Godine 1958. Hoagland i Zamechnik, kao i P. Berg, R. Sweet i F. Allen, te mnogi drugi istraživači otkrili su da je za aktivaciju svake aminokiseline potreban vlastiti poseban enzim, ATP i specifična tRNA. Postalo je jasno da tRNA obavljaju isključivo funkciju adaptora, odnosno adaptacija koje na matrici nukleinske kiseline (mRNA) pronalaze mjesto odgovarajuće aminokiseline u tvornoj proteinskoj molekuli. Ove studije u potpunosti su potvrdile adaptornu hipotezu F. Cricka (1957), koja je predviđala postojanje polinukleotidnih adaptera u stanici, neophodnih za ispravan raspored aminokiselinskih ostataka sintetiziranog proteina na nukleinskom matriksu. Mnogo kasnije je francuski znanstvenik F. Chapville (1962.) u laboratoriju F. Lipmana (Nobelova nagrada, 1953.) u SAD-u vrlo duhovito i nedvosmisleno pokazao da je mjesto aminokiseline u sintetiziranoj proteinskoj molekuli potpuno određeno specifične tRNA na koju je vezan. Hipotezu Crickovog adaptera razvili su Hoagland i Zamechnik.
Do 1958. godine postale su poznate sljedeće glavne faze sinteze proteina: 1) aktivacija aminokiseline specifičnim enzimom iz "pH 5 frakcije" u prisutnosti ATP-a uz stvaranje aminoaciladenilata; 2) vezanje aktivirane aminokiseline na specifičnu tRNA uz oslobađanje adenozin monofosfata (AMP); 3) vezanje aminoacil-tRNA (tRNA napunjene aminokiselinom) s mikrosomima i ugradnja aminokiselina u protein uz oslobađanje tRNA. Hoagland (1958) je primijetio da je gvanozin trifosfat (GTP) potreban u posljednjoj fazi sinteze proteina.
Nakon otkrića tRNA započela je aktivna potraga za njihovim frakcioniranjem i određivanjem nukleotidnog slijeda. Najveći uspjeh postigao je američki biokemičar R. Holly. Godine 1965. ustanovio je strukturu alaninske tRNA iz kvasca. Koristeći ribonukleaze (guanil RNA-aza i RNA-aza gušterače), Holly je podijelila molekulu nukleinske kiseline u nekoliko fragmenata, odredila nukleotidni slijed u svakom od njih posebno, a zatim rekonstruirala slijed cijele molekule alanina tRNA. Ovaj način analize nukleotidnog slijeda naziva se blok metoda. Hollyjeva se zasluga sastojala uglavnom u činjenici da je naučio podijeliti molekulu RNA ne samo na male komadiće, kao što su mnogi činili prije njega, već i na velike fragmente (četvrtine i polovice). To mu je dalo priliku da ispravno sastavi pojedinačne male komadiće i tako ponovno stvori kompletan slijed nukleotida cijele molekule tRNA (Nobelova nagrada, 1968.).
Ovu tehniku odmah su usvojili mnogi laboratoriji diljem svijeta. Tijekom sljedeće dvije godine dešifrirana je primarna struktura nekoliko tRNA u SSSR-u i inozemstvu. A. A. Baev (1967) i suradnici prvi su ustanovili slijed nukleotida u valinskoj tRNA kvasca. Do danas je proučavano više od desetak različitih pojedinačnih tRNA. Svojevrsni rekord u određivanju nukleotidnog slijeda postavili su u Cambridgeu F. Senger i G. Brownlee. Ovi istraživači razvili su iznenađujuće elegantnu metodu za odvajanje oligonukleotida i ustanovili slijed takozvane 5S (ribosomalne) RNA iz stanica E. coli (1968.). Ova RNA se sastoji od 120 nukleotidnih ostataka i, za razliku od tRNA, ne sadrži dodatne manje baze, koje značajno olakšavaju analizu nukleotidnog slijeda, služeći kao jedinstveni orijentiri za pojedine fragmente molekule. Trenutno, zahvaljujući korištenju metode Sanger i Brownlee, rad na proučavanju slijeda dugih ribosomskih RNA i nekih virusnih RNA u laboratoriju J. Ebela (Francuska) i drugih istraživača uspješno napreduje.
AA Baev i suradnici (1967.) otkrili su da valinska tRNA prerezana na pola obnavlja svoju makromolekularnu strukturu u otopini i, unatoč defektu u primarnoj strukturi, ima funkcionalnu aktivnost izvorne (nativne) molekule. Ovaj pristup - rekonstrukcija izrezane makromolekule nakon uklanjanja određenih fragmenata - pokazao se vrlo obećavajućim. Danas se naširoko koristi za razjašnjavanje funkcionalne uloge pojedinih regija određenih tRNA.
Posljednjih godina postignut je veliki uspjeh u pripremi kristalnih pripravaka pojedinih tRNA. Sada su u nekoliko laboratorija u SAD-u i Engleskoj mnoge tRNA već kristalizirane. To je omogućilo proučavanje strukture tRNA pomoću rendgenske strukturne analize. Godine 1970. R. Bock je predstavio prve uzorke difrakcije rendgenskih zraka i trodimenzionalne modele nekoliko tRNA, koje je stvorio na Sveučilištu Wisconsin. Ovi modeli pomažu odrediti lokalizaciju pojedinih funkcionalno aktivnih mjesta u tRNA i razumjeti osnovne principe funkcioniranja tih molekula.
Dešifriranje prirode genetskog koda (vidi poglavlje 24), koji se bez pretjerivanja može smatrati vodećim osvajanjem prirodnih znanosti u 20. stoljeću, bilo je od iznimne važnosti za otkrivanje mehanizma sinteze proteina i rješavanje problema specifičnosti ovog procesa.
R. Hollyjevo otkrivanje primarne strukture tRNA dalo je poticaj radovima G. Korane * (SAD) o sintezi oligonukleotida i usmjerilo ih prema sintezi specifične biološke strukture - molekule DNA koja kodira alanin tRNA. Prvi koraci u kemijskoj sintezi kratkih oligonukleotida, koje je napravio Kuran prije gotovo 15 godina, dovršeni su 1970. godine prvom sintezom gena. Korana i njegovi suradnici prvi su kemijskim putem sintetizirali kratke fragmente od 8-12 nukleotidnih ostataka iz pojedinih nukleotida. Ovi fragmenti s danim nukleotidnim slijedom formirali su spontano dvolančane komplementarne dijelove s preklapanjem od 4-5 nukleotida. Zatim su ovi gotovi komadi željenim redoslijedom naizmjence povezani s kraja na kraj pomoću enzima DNA ligaze. Dakle, za razliku od replikacije molekula DNK, prema A. Kornbergu ** (vidi poglavlje 24), Kuran je mogao ponovno stvoriti prirodnu dvolančanu molekulu DNA prema unaprijed planiranom programu u skladu s tRNA sekvenca koju je opisao Holly. Slično, sada se radi na sintezi drugih gena (MN Kolosov, Z. A. Shabarova, DG Knorre, 1970. - 1975.).
* (Za proučavanje genetskog koda G. Korana i M. Nirenberg dobili su Nobelovu nagradu 1968. godine.)
** (Za otkriće polimeraze i sinteze DNA A. Kornberg, a za sintezu RNA S. Ochoa je 1959. dobio Nobelovu nagradu.)
Sredinom 1950-ih vjerovalo se da su mikrosomi centar sinteze proteina u stanici. Pojam mikrosomi prvi je uveo 1949. A. Claude za označavanje frakcije malih granula. Kasnije se pokazalo da nije cijela frakcija mikrosoma, koja se sastoji od membrana i granula, odgovorna za sintezu proteina, već samo male čestice ribonukleoproteina. Ove su čestice 1958. nazvane ribosomima R. Robertsa.
Klasične studije bakterijskih ribosoma proveli su A. Tissier i J. Watson 1958. - 1959. godine. Utvrđeno je da su bakterijski ribosomi nešto manji od biljaka i životinja. J. Littleton (1960), M. Clarke (1964) i E.N.Svetailo (1966) pokazali su da ribosomi kloroplasta viših biljaka i mitohondrija pripadaju bakterijskom tipu. A. Tissier i drugi (1958) otkrili su da se ribosomi razdvajaju u dvije nejednake podjedinice koje sadrže jednu RNA molekulu. U kasnim 1950-ima vjerovalo se da se svaka molekula ribosomske RNA sastoji od nekoliko kratkih fragmenata. Međutim, A.S.Spirin je 1960. godine po prvi put pokazao da je RNA u podčesticama predstavljena kontinuiranom molekulom. D. Waller (1960), odvajajući ribosomske proteine pomoću elektroforeze u škrobnom gelu, otkrio je da su oni vrlo heterogeni. U početku su mnogi sumnjali u Wallerove podatke, jer se činilo da bi protein ribosoma trebao biti strogo homogen, kao što je TMV protein. Trenutno, kao rezultat istraživanja D. Wallera, R. Trouta, P. Trauba i drugih biokemičara, postalo je poznato da sastav samih ribosomskih čestica uključuje više od 50 proteina koji su potpuno različite strukture. A.S. Spirin je 1963. godine prvi razmotao ribosomske podjedinice i pokazao da su ribosomi kompaktno uvijeni lanac ribonukleoproteina koji se može odvijati pod određenim uvjetima. 1967-1968 M. Nomura je u potpunosti rekonstruirao biološki aktivnu podjedinicu iz ribosomske RNA i proteina te čak dobio ribosome u kojima su protein i RNA pripadali različitim mikroorganizmima.
Do sada je uloga ribosomske RNA nejasna. Pretpostavlja se da je to ona jedinstvena specifična matrica na kojoj, tijekom formiranja ribosomske čestice, svaki od brojnih ribosomskih proteina nalazi strogo određeno mjesto (A.S. Spirin, 1968).
A. Rich (1962.) otkrio je agregate nekoliko ribosoma međusobno povezanih mRNA niti. Ti su kompleksi nazvani polisomi. Otkriće polisoma omogućilo je Richu i Watsonu (1963.) da sugeriraju da se sinteza polipeptidnog lanca događa na ribosomu, koji se, takoreći, kreće duž lanca mRNA. Kako se ribosom kreće duž lanca mRNA, informacija se čita u čestici i formira se polipeptidni lanac proteina, a novi ribosomi se naizmjenično vežu na oslobođeni kraj za čitanje mRNA. Iz podataka Richa i Watsona proizlazi da se značaj polisoma u stanici sastoji u masovnoj proizvodnji proteina sekvencijalnim čitanjem matriksa od strane nekoliko ribosoma odjednom.
Kao rezultat istraživanja M. Nirenberga, S. Ochoe, F. Lipmana, G. Korane i drugih 1963. - 1970. godine. postalo je poznato da je uz mRNA, ribosome, ATP i aminoacil-tRNA u proces translacije uključen veliki broj različitih čimbenika, a sam proces translacije se uvjetno može podijeliti u tri faze – inicijaciju, samu translaciju i terminaciju.
Inicijacija translacije znači sintezu prve peptidne veze u kompleksu ribosom – šablonski polinukleotid – aminoacil-tRNA. Ovu aktivnost pokretača ne posjeduje nijedna aminoacil-tRNA, već formilmetionil-tRNA. Ovu su tvar prvi put izolirali 1964. F. Senger i K. Marker. S. Bretcher i K. Marker (1966) pokazali su da je inicijatorska funkcija formilmetionil-tRNA posljedica njezina povećanog afiniteta za peptidilni centar ribosoma. Za početak translacije iznimno su važni i neki faktori inicijacije proteina, koji su izolirani u laboratorijima S. Ochoa, F. Gro i drugih istraživačkih centara. Nakon formiranja prve peptidne veze u ribosomu, počinje stvarna translacija, tj. sekvencijalno vezivanje aminoacilnog ostatka na C-terminus polipeptida. Mnoge pojedinosti procesa emitiranja proučavali su K. Monroe i J. Bishop (Engleska), I. Rykhlik i F. Schorm (Čehoslovačka), F. Lipman, M. Bretcher, W. Gilbert (SAD) i drugi istraživači. Godine 1968. A.S.Spirin je predložio originalnu hipotezu za objašnjenje mehanizma ribosoma. Pokretački mehanizam koji osigurava sva prostorna kretanja tRNA i mRNA tijekom translacije je periodično otvaranje i zatvaranje podjedinica ribosoma. Kraj prijevoda je kodiran u samoj čitljivoj matrici koja sadrži završne kodone. Kao što je pokazao S. Brenner (1965. - 1967.), takvi kodoni su tripleti UAA, UAG i UGA. M. Capecchi (1967) također je identificirao posebne čimbenike terminacije proteina. AS Spirin i LP Gavrilova opisali su takozvanu "neenzimsku" sintezu proteina u ribosomima (1972. - 1975.) bez sudjelovanja proteinskih čimbenika. Ovo otkriće važno je za razumijevanje nastanka i evolucije biosinteze proteina.
Nakon problema specifičnosti sinteze proteina, na prvom mjestu u molekularnoj biologiji pokazao se problem regulacije sinteze proteina, odnosno, što je isto, regulacije aktivnosti gena.
Funkcionalna nejednakost stanica i povezana represija i aktivacija gena dugo su privlačili pozornost genetičara, no donedavno je pravi mehanizam kontrole aktivnosti gena ostao nepoznat.
Prvi pokušaji da se objasni regulatorna aktivnost gena povezani su s proučavanjem histonskih proteina. Čak i supružnici Steadman * početkom 40-ih godina XX. stoljeća. izrazio je ideju da upravo histoni mogu igrati glavnu ulogu u ovom fenomenu. Nakon toga su dobili prve jasne podatke o razlikama u kemijskoj prirodi histonskih proteina. Trenutno se svake godine povećava broj činjenica koje podupiru ovu hipotezu.
* (E. Stedman, E. Stedman. Osnovni proteini staničnih jezgri - Phylosoph. Trans. Roy. Soc. London, 1951., v. 235, 565 - 595 (prikaz, stručni).)
Istovremeno se nakuplja sve više podataka koji ukazuju na to da je regulacija aktivnosti gena puno složeniji proces od jednostavne interakcije genskih regija s molekulama histonskih proteina. 1960-1962 U laboratoriju RB Khesin-Lurie ustanovljeno je da se geni faga počinju čitati neistovremeno: geni T2 faga mogu se podijeliti na rane gene čije se funkcioniranje dogodilo u prvim minutama infekcije bakterijske stanice. , i kasnih gena, koji su počeli sintetizirati mRNA nakon završetka ranih gena.
Godine 1961. francuski biokemičari F. Jacob i J. Monod predložili su shemu za regulaciju aktivnosti gena, koja je imala iznimnu ulogu u razumijevanju regulacijskih mehanizama stanice općenito. Prema Jacob i Monod shemi, osim strukturnih (informacijskih) gena, DNK sadrži i regulatorne gene i gene operatora. Genski regulator kodira sintezu specifične tvari – represora, koji se može pričvrstiti i na induktor i na gen operatora. Operatorski gen je vezan za strukturne geni, a gen regulatora nalazi se na određenoj udaljenosti od njih. Ako u okolini nema induktora, na primjer, laktoze, tada se represor koji sintetizira regulatorni gen veže na gen operatora i, blokirajući ga, isključuje rad cijelog operona (blok strukturnih gena zajedno s operatorom). koji ih kontrolira). Enzim se ne stvara pod tim uvjetima. Ako se u mediju pojavi induktor (laktoza), tada se proizvod regulatornog gena - represor - veže na laktozu i uklanja blok s gena operatora. U tom slučaju postaje moguć rad strukturnog gena koji kodira sintezu enzima, a enzim (laktoza) se pojavljuje u mediju.
Prema Jacobu i Monodu, ova regulacijska shema primjenjiva je na sve adaptivne enzime i može se odvijati kako tijekom potiskivanja, kada je stvaranje enzima potisnuto suviškom produkta reakcije, tako i tijekom indukcije, kada dodavanje supstrata uzrokuje sintezu enzima. Jacob i Monod dobili su Nobelovu nagradu 1965. za svoje studije o regulaciji aktivnosti gena.
U početku se ova shema činila previše nategnutom. Međutim, kasnije je postalo jasno da se regulacija gena prema ovom principu odvija ne samo u bakterijama, već i u drugim organizmima.
Od 1960. godine istaknuto mjesto u molekularnoj biologiji zauzimaju proučavanja organizacije genoma i strukture kromatina u eukariotskim organizmima (J. Bonner, R. Britten, W. Alfrey, P. Walker, Yu.S. Chentsov, IB Zbarsky, itd. . .) i regulacije transkripcije (A. Mirsky, G. P. Georgiev, M. Bernstil, D. Goll, R. Tsanev, R. I. Salganik). Priroda represora dugo je ostala nepoznata i kontroverzna. 1968. M. Ptashne (SAD) pokazao je da je protein represor. Izolirao ga je u laboratoriju J. Watsona i otkrio da represor, doista, ima afinitet prema induktoru (laktozi) i istovremeno "prepoznaje" genski operator lac operona i specifično se veže za njega.
U posljednjih 5 - 7 godina dobiveni su podaci o prisutnosti još jedne kontrolne stanice genske aktivnosti - promotora. Pokazalo se da se u blizini mjesta operatera, na koje je spojen proizvod sintetiziran na gen-regulatoru, proteinska tvar represora, nalazi još jedno mjesto, koje također treba pripisati članovima regulacijskog sustava. aktivnosti gena. Na ovo mjesto je vezana proteinska molekula enzima RNA polimeraze. U promotorskoj regiji trebalo bi doći do međusobnog prepoznavanja jedinstvene nukleotidne sekvence u DNA i specifične konfiguracije proteina RNA polimeraze. Provedba procesa čitanja genetskih informacija s zadanim genskim slijedom operona uz promotor ovisit će o učinkovitosti prepoznavanja.
Osim sheme koju su opisali Jacob i Monod, postoje i drugi mehanizmi regulacije gena u stanici. F. Jacob i S. Brenner (1963.) otkrili su da regulaciju replikacije bakterijske DNA na određeni način kontrolira stanična membrana. Pokusi Jacoba (1954) na indukciji različitih profaga uvjerljivo su pokazali da pod utjecajem različitih mutagenih čimbenika u stanici lizogenih bakterija počinje selektivna replikacija profag gena, a replikacija genoma domaćina je blokirana. Godine 1970. F. Bell je izvijestio da male molekule DNA mogu prijeći u citoplazmu iz jezgre i tamo biti transkribirane.
Dakle, regulacija aktivnosti gena može se provesti na razini replikacije, transkripcije i translacije.
Značajan napredak postignut je u proučavanju regulacije ne samo sinteze enzima, već i njihove aktivnosti. Na fenomene regulacije enzimske aktivnosti u stanici ukazali su još 50-ih godina A. Novik i L. Szilard. G. Umbarger (1956) ustanovio je da u stanici postoji vrlo racionalan način supresije enzima pomoću krajnjeg produkta povratnog lanca. Kako su ustanovili J. Monod, J. Changer, F. Jacob, A. Purdy i drugi istraživači (1956. - 1960.), regulacija aktivnosti enzima može se provoditi prema alosteričnom principu. Enzim ili jedna od njegovih podjedinica, osim afiniteta za supstrat, ima afinitet za jedan od proizvoda lanca reakcija. Pod utjecajem takvog signalnog produkta enzim mijenja svoju konformaciju tako da gubi svoju aktivnost. Kao rezultat, cijeli lanac enzimskih reakcija je isključen na samom početku. D. Weyman i R. Woodward (1952; dobitnik Nobelove nagrade, 1965) ukazali su na bitnu ulogu proteinskih konformacijskih promjena u enzimskim reakcijama, te u određenom smislu na prisutnost alosteričkog učinka.
Kao rezultat radova T. Osbornea, G. Hofmeistera, A. Gürbera, F. Schulza i mnogih drugih krajem XIX. mnogi životinjski i biljni proteini dobiveni su u kristalnom obliku. Otprilike u isto vrijeme korištene su različite fizikalne metode za utvrđivanje molekularne težine nekih proteina. Tako su 1891. A. Sabaneev i N. Aleksandrov izvijestili da je molekularna težina ovalbumina 14 000; 1905. E. Reid je ustanovio da je molekularna težina hemoglobina 48 000. Polimernu strukturu proteina otkrili su 1871. G. Glazivets i D. Haberman. Ideju o peptidnoj vezi pojedinih aminokiselinskih ostataka u proteinima iznio je T. Curtius (1883). Rad na kemijskoj kondenzaciji aminokiselina (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano i D. Truschiatti, 1900) i sintezi heteropolipeptida (E. Fischer, 1902 - 1907, Nobelova nagrada2, 1900). dovela je do razvoja osnovnih principa kemijske strukture proteina.
Prvi kristalni enzim (ureazu) dobio je 1926. J. Sumner (Nobelova nagrada, 1946.), a 1930. J. Northrop (Nobelova nagrada, 1946.) dobio je kristalni pepsin. Nakon ovih radova postalo je jasno da su enzimi proteinske prirode. Godine 1940. M. Kunits je izolirao kristalnu RNK-azu. Do 1958. već je bilo poznato više od 100 kristalnih enzima i više od 500 enzima izoliranih u nekristaliničnom obliku. Priprava visokopročišćenih pripravaka pojedinih proteina pridonijela je dešifriranju njihove primarne strukture i makromolekularne organizacije.
Od velike važnosti za razvoj molekularne biologije općenito, a posebice ljudske genetike, bilo je otkriće L. Paulinga (1940) abnormalnog hemoglobina S izoliranog iz eritrocita osoba s teškom nasljednom bolešću – anemijom srpastih stanica. Godine 1955-1957 V. Ingram koristio je metodu "otisaka prstiju" (mrlje koje nastaju pojedinačnim peptidima tijekom kromatografije na papiru) koju je razvio F. Senger za analizu produkata hidrolize hemoglobina S s alkalijom i tripsinom. Ingram je 1961. izvijestio da se hemoglobin S od normalnog hemoglobina razlikuje samo po prirodi jednog aminokiselinskog ostatka: u normalnom hemoglobinu na sedmoj poziciji lanca nalazi se ostatak glutaminske kiseline, a u hemoglobinu S nalazi se ostatak valina. To je u potpunosti potvrdilo (1949.) Paulingovu pretpostavku da je anemija srpastih stanica bolest molekularne prirode. Nasljedna promjena samo jednog aminokiselinskog ostatka u svakoj polovici makromolekule hemoglobina dovodi do činjenice da hemoglobin gubi sposobnost lakog otapanja pri niskim koncentracijama kisika i počinje kristalizirati, što dovodi do kršenja stanične strukture. Ove studije su jasno pokazale da je struktura proteina strogo definirana sekvenca aminokiselina, koja je kodirana u genomu. O iznimnoj važnosti primarne strukture proteina u stvaranju jedinstvene biološki aktivne konformacije makromolekule svjedoče radovi K. Anfinsena (1951). Anfinsen je pokazao da je biološki aktivna makrostruktura pankreasne ribonukleaze izgubljena kao rezultat redukcije unaprijed određena aminokiselinskim slijedom i da se može ponovno pojaviti spontano nakon oksidacije SH-skupina cisteinskih ostataka uz stvaranje disulfidnih poprečnih veza na strogo određenim mjestima peptidni lanac enzima.
Do danas je detaljno proučen mehanizam djelovanja velikog broja enzima i utvrđena je struktura mnogih proteina.
Godine 1953. F. Senger je ustanovio aminokiselinsku sekvencu inzulina. : Ovaj protein se sastoji od dva polipeptidna lanca povezana s dvije disulfidne poprečne veze. Jedan od lanaca sadrži samo 21 aminokiselinski ostatak, dok drugi sadrži 30 ostataka. Sanger je proveo oko 10 godina kako bi dešifrirao strukturu ovog relativno jednostavnog proteina. Za ovo izvanredno istraživanje 1958. godine dobio je Nobelovu nagradu. Nakon što su W. Stein i S. Moore (1957.) stvorili automatski analizator aminokiselina, značajno je ubrzana identifikacija produkata djelomične hidrolize proteina. Stein i Moore su to već izvijestili 1960. godine. da su uspjeli odrediti slijed ribonukleaze, čiji je peptidni lanac predstavljen sa 124 aminokiselinske ostatke. Iste godine u laboratoriju G. Schramma u Tübingenu (Njemačka) F. Anderer i drugi odredili su aminokiselinsku sekvencu u TMV proteinu. Zatim je određen aminokiselinski slijed u mioglobinu (A. Edmunson) i α- i β-lancima ljudskog hemoglobina (G. Braunitzer, E. Schroeder i dr.), lizozimu iz proteina kokošjeg jajeta (J. Jollet, D. Keyfield ). Godine 1963. F. Schorm i B. Keil (Čehoslovačka) uspostavili su slijed aminokiselina u molekuli kimotripsinogena. Iste godine određena je aminokiselinska sekvenca tripsinogena (F. Schorm, D. Walsh). Godine 1965. K. Takahashi uspostavio je primarnu strukturu ribonukleaze T1. Zatim je aminokiselinska sekvenca određena u još nekoliko proteina.
Kao što znate, konačni dokaz ispravnosti definicije određene strukture je njezina sinteza. Godine 1969. R. Merifield (SAD) prvi je kemijski sintetizirao pankreasnu ribonukleazu. Koristeći metodu sinteze koju je razvio na nosaču čvrste faze, Merifield je dodavao jednu za drugom aminokiselinu u lanac u skladu sa slijedom koji su opisali Stein i Moore. Kao rezultat toga, dobio je protein koji je po svojim kvalitetama bio identičan ribonukleazi A gušterače. Za otkrivanje strukture ribonukleaze V. Stein, S. Moore i K. Anfinsen dobili su Nobelovu nagradu 1972. godine. Ova prirodna sinteza proteina otvara velike izglede, što ukazuje na mogućnost stvaranja bilo kojeg proteina u skladu s unaprijed planiranim slijedom.
Iz studija difrakcije X-zraka W. Astburyja (1933) proizlazi da su peptidni lanci proteinskih molekula uvrnuti ili presavijeni na neki strogo definiran način. Od tada su mnogi autori iznosili različite hipoteze o metodama presavijanja proteinskih lanaca, ali do 1951. svi su modeli ostali spekulativne konstrukcije koje nisu odgovarale eksperimentalnim podacima. Godine 1951. L. Pauling i R. Corey objavili su niz briljantnih radova u kojima je konačno formulirana teorija sekundarne strukture proteina – teorija α-heliksa. Uz to, također je postalo poznato da proteini također imaju tercijarnu strukturu: α-helix peptidnog lanca može se na određeni način presavijati, tvoreći prilično kompaktnu strukturu.
Godine 1957. J. Kendrew i njegovi suradnici su prvi put predložili trodimenzionalni model strukture mioglobina. Taj se model potom nekoliko godina usavršavao, dok se 1961. godine nije pojavio konačni rad s karakterizacijom prostorne strukture ovog proteina. Godine 1959. M. Perutz i suradnici uspostavili su trodimenzionalnu strukturu hemoglobina. Istraživači su proveli više od 20 godina na ovom radu (prve radiografije hemoglobina napravio je Perutz 1937.). Budući da se molekula hemoglobina sastoji od četiri podjedinice, Perutz je, dešifrirajući njegovu organizaciju, najprije opisao kvarternu strukturu proteina. Kendrew i Perutz su 1962. dobili Nobelovu nagradu za svoj rad na određivanju trodimenzionalne strukture proteina.
OMOGUĆENO stvaranje prostornog modela strukture hemoglobina od strane Perutza. približiti se razumijevanju mehanizma funkcioniranja ovog proteina, koji, kao što znate, obavlja prijenos kisika u životinjskim stanicama. Još 1937. godine F. Gaurovitz je došao do zaključka da bi interakcija hemoglobina s kisikom, zrakom trebala biti popraćena promjenom strukture proteina. U 1960-ima, Perutz i njegovi suradnici otkrili su primjetno pomicanje lanaca hemoglobina nakon oksidacije, uzrokovano pomakom u atomima željeza kao rezultatom vezanja s kisikom. Na temelju toga su se formirale ideje o "disanju" proteinskih makromolekula.
Godine 1960. D. Phillips i njegovi suradnici započeli su rendgenske strukturne studije molekule lizozima. Do 1967. godine manje-više točno su uspjeli utvrditi detalje organizacije ovog proteina i lokalizacije pojedinih atoma u njegovoj molekuli. Osim toga, Phillips je otkrio prirodu vezanja lizozima na supstrat (triacetilglukozamin). To je omogućilo ponovno stvaranje mehanizma rada ovog enzima. Dakle, poznavanje primarne strukture i makromolekularne organizacije omogućilo je ne samo utvrđivanje prirode aktivnih centara mnogih enzima, već i potpuno otkrivanje mehanizma funkcioniranja tih makromolekula.
Korištenje metoda elektronske mikroskopije pomoglo je u otkrivanju principa makromolekularne organizacije tako složenih proteinskih formacija kao što su kolagen, fibrinogeni filamenti, kontraktilna mišićna vlakna itd. Kasnih 50-ih godina predloženi su modeli mišićnog kontraktilnog aparata. Otkriće ATPazne aktivnosti miozina od strane V.A.Engel'gardta i M.N.Lyubimove (1939) bilo je od izuzetne važnosti za razumijevanje mehanizma mišićne kontrakcije. To je značilo da se čin mišićne kontrakcije temelji na promjeni fizikalno-kemijskih svojstava i makromolekularne organizacije kontraktilnog proteina pod utjecajem adenozin trifosforne kiseline (vidi također Poglavlje 11).
Virološke studije bile su bitne za razumijevanje principa sastavljanja bioloških struktura (vidi Poglavlje 25).
Glavni napredak u modernoj molekularnoj biologiji postignut je uglavnom kao rezultat proučavanja nukleinskih kiselina. Ipak, i na ovom području daleko su svi problemi riješeni. Konkretno, dekodiranje cjelokupne sekvence nukleotida genoma zahtijevat će velike napore. Taj je problem, pak, neraskidivo povezan s problemom heterogenosti DNK i zahtijeva razvoj novih naprednih metoda frakcioniranja i izolacije pojedinih molekula iz ukupnog genetskog materijala stanice.
Do sada su napori uglavnom bili usmjereni na odvojeno proučavanje proteina i nukleinskih kiselina. U stanici su ti biopolimeri međusobno neraskidivo povezani i djeluju uglavnom u obliku nukleoproteina. Stoga je potreba za proučavanjem interakcije proteina i nukleinskih kiselina sada postala posebno akutna. Istaknut je problem prepoznavanja od strane proteina pojedinih regija nukleinskih kiselina. Već su zacrtani koraci prema proučavanju takve interakcije ovih biopolimera, bez kojih je nezamislivo potpuno razumijevanje strukture i funkcija kromosoma, ribosoma i drugih struktura. Bez toga je također nemoguće razumjeti regulaciju genske aktivnosti i konačno dešifrirati principe mehanizama za sintezu proteina. Nakon rada Jacoba i Monoda, pojavili su se novi podaci o regulatornoj ulozi membrana u sintezi nuklearnog materijala. To postavlja problem dubljeg proučavanja uloge membrana u regulaciji replikacije DNA. Općenito, problem regulacije aktivnosti gena i stanične aktivnosti općenito postao je jedan od najvažnijih problema moderne molekularne biologije.
Biofizika se razvijala u bliskoj vezi s problemima molekularne biologije. Interes za ovo područje biologije potaknut je, s jedne strane, potrebom za sveobuhvatnim proučavanjem djelovanja različitih vrsta zračenja na tijelo, s druge, potrebom proučavanja fizikalnih i fizikalno-kemijskih osnova životni fenomeni koji se javljaju na molekularnoj razini.
Točne informacije o molekularnim strukturama i procesima koji se u njima odvijaju postali su mogući kao rezultat primjene novih finih fizikalno-kemijskih metoda. Na temelju dostignuća elektrokemije bilo je moguće unaprijediti metodu mjerenja bioelektričnih potencijala korištenjem ionsko-selektivnih elektroda (G. Eisenman, B. P. Nikol'skii, Khuri, 1950-ih - 1960-ih). Sve je češća infracrvena spektroskopija (uz korištenje laserskih uređaja), koja omogućuje proučavanje konformacijskih promjena proteina (I. Plotnikov, 1940). Vrijedne informacije također pružaju metoda elektronske paramagnetske rezonancije (EK Zavoisky, 1944.) i biokemoluminiscentna metoda (BN Tarusov i sur., 1960.), koje omogućuju, posebno, prosuđivanje transporta elektrona tijekom oksidativnih procesa.
Do 50-ih godina biofizika već zauzima jaku poziciju. Postoji potreba za obukom kvalificiranih stručnjaka. Ako je 1911. u Europi samo na Sveučilištu u Pečuhu, u Mađarskoj, postojao odjel za biofiziku, onda do 1973. takvi odjeli postoje na gotovo svim velikim sveučilištima.
Godine 1960. organizirano je Međunarodno društvo biofizičara. U kolovozu 1961. u Stockholmu je održan prvi Međunarodni biofizički kongres. Drugi kongres održan je 1965. u Parizu, treći 1969. u Bostonu, a četvrti 1972. u Moskvi.
U biofizici postoji jasna razlika između dva područja različitog sadržaja – molekularne biofizike i stanične biofizike. Ova razlika dobiva i organizacijski izraz: stvaraju se odvojeni odjeli ova dva područja biofizike. Na Moskovskom sveučilištu prvi odsjek za biofiziku osnovan je 1953. na Fakultetu za biologiju i tlo, a nešto kasnije na Fizičkom fakultetu osnovan je Odsjek za biofiziku. Odsjeci na mnogim drugim sveučilištima organizirani su na isti način.
Posljednjih godina odnos između molekularne biofizike i molekularne biologije sve je više ojačan, a sada je ponekad teško odrediti gdje se nalazi međusklop između njih. U općem napadu na problem nasljednih informacija takva je suradnja biofizike s molekularnom biologijom neizbježna.
Glavni smjer istraživanja je proučavanje fizike nukleinskih kiselina - DNA i RNA. Korištenje navedenih metoda i prije svega rendgenska strukturna analiza pridonijela je dešifriranju molekularne strukture nukleinskih kiselina. Trenutno su u tijeku intenzivna istraživanja za proučavanje ponašanja ovih kiselina u otopinama. Posebna se pozornost posvećuje konformacijskim prijelazima "spiralna zavojnica", proučavanim promjenama viskoznosti, optičkim i električnim pokazateljima. U vezi s proučavanjem mehanizama mutageneze razvijaju se studije koje proučavaju učinak ionizirajućeg zračenja na ponašanje nukleinskih kiselina u otopinama, kao i učinak zračenja na nukleinske kiseline virusa i faga. Utjecaj ultraljubičastog zračenja podvrgnut je opsežnoj analizi, za čije se neke spektralne regije zna da dobro apsorbiraju nukleinske kiseline. Detekcija aktivnih radikala nukleinskih kiselina i proteina metodom elektronske paramagnetske rezonancije zauzima veliki udio u ovoj vrsti istraživanja. Korištenje ove metode povezano je s pojavom cijelog neovisnog smjera.
Problem kodiranja informacija o DNA i RNA i njihovog prijenosa tijekom sinteze proteina dugo je bio od interesa za molekularnu biofiziku, a fizičari su u više navrata izrazili određena razmatranja o ovom pitanju (E. Schrödinger, G. Gamow). Dešifriranje genetskog koda izazvalo je brojne teorijske i eksperimentalne studije o strukturi spirale DNK, mehanizmu klizanja i uvijanja njezinih niti, o proučavanju fizičkih sila uključenih u te procese.
Molekularna biofizika pruža molekularnoj biologiji značajnu pomoć u proučavanju strukture proteinskih molekula korištenjem rendgenske difrakcijske analize, koju je prvi 1930. upotrijebio J. Bernal. Kao rezultat primjene fizikalnih metoda u kombinaciji s biokemijskim (enzimskim metodama) otkrivena je molekularna konformacija i slijed aminokiselina u nizu proteina.
Moderne elektronske mikroskopske studije, koje su otkrile prisutnost složenih membranskih sustava u stanicama i njihovim organelama, potaknule su pokušaje razumijevanja njihove molekularne strukture (vidi 10. i 11. poglavlja). Proučava se kemijski sastav membrana in vivo, a posebno svojstva njihovih lipida. Utvrđeno je da su potonji sposobni za peroksidaciju i neenzimske reakcije lančane oksidacije (Yu. A. Vladimirov i F. F. Litvin, 1959; B. N. Tarusov i sur., 1960; I. I. Ivanov, 1967), što dovodi do kršenja membranskih funkcija . Metode matematičkog modeliranja također su korištene za proučavanje sastava membrana (V. Ts. Presman, 1964 - 1968; M. M. Shemyakin, 1967; Yu. A. Ovchinnikov, 1972).
Značajan događaj u povijesti biofizike bilo je formiranje 50-ih godina 20. stoljeća jasnog razumijevanja termodinamike bioloških procesa, uslijed čega su nastale pretpostavke o mogućnosti neovisnog stvaranja energije u živim stanicama unatoč drugom zakonu termodinamika je konačno nestala. Razumijevanje djelovanja ovog zakona u biološkim sustavima povezano je s uvođenjem belgijskog znanstvenika I. Prigoginea (1945.) * u biološku termodinamiku koncepta otvorenih sustava koji razmjenjuju energiju i materiju s vanjskim okolišem. Prigogin je pokazao da se pozitivna entropija stvara u živim stanicama tijekom radnih procesa u skladu s drugim zakonom termodinamike. Jednadžbe koje je uveo određivale su uvjete pod kojima nastaje takozvano stacionarno stanje (ranije se zvalo i dinamička ravnoteža), u kojem količina slobodne energije (negentropije) koja ulazi u stanice s hranom nadoknađuje njenu potrošnju, a pozitivna entropija iznosi izveden. Ovo otkriće poduprlo je opću biološku ideju o neraskidivoj vezi između vanjskog i unutarnjeg okruženja stanica. To je označilo početak pravog proučavanja termodinamike "živih" sustava, uključujući i metodu modeliranja (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).
* (Opću teoriju otvorenih sustava prvi je iznio L. Bertalanffy 1932. godine.)
Prema osnovnom principu biotermodinamike, nužan uvjet za postojanje života je stacionarnost u razvoju njegovih biokemijskih procesa, za čiju je provedbu potrebno uskladiti brzine brojnih metaboličkih reakcija. Na temelju nove biofizičke termodinamike nastao je smjer koji razlikuje vanjske i unutarnje čimbenike koji osiguravaju tu koordinaciju reakcija i čine je stabilnom. Tijekom posljednja dva desetljeća otkrivena je velika uloga u održavanju stabilnog stanja sustava inhibitora, a posebno antioksidansa (BN Tarusov i AI Zhuravlev, 1954., 1958.). Utvrđeno je da je pouzdanost stacionarnog razvoja povezana s okolišnim čimbenicima (temperatura) i fizikalno-kemijskim svojstvima stanične okoline.
Suvremeni principi biotermodinamike omogućili su fizikalno-kemijsko tumačenje mehanizma prilagodbe. Prema našim podacima, prilagodba na uvjete okoliša može se dogoditi samo ako je, mijenjajući ih, organizam u stanju uspostaviti stacionarnost u razvoju biokemijskih reakcija (BN Tarusov, 1974). Postavilo se pitanje razvoja novih metoda koje bi omogućile procjenu stacionarnog stanja in vivo i predviđanje njegovih mogućih kršenja. Uvođenje kibernetičkih principa samoregulirajućih sustava u biotermodinamiku i istraživanje procesa biološke prilagodbe obećavaju velike prednosti. Postalo je jasno da je za rješavanje problema stabilnosti stacionarnog stanja važno uzeti u obzir takozvane ometajuće čimbenike, koji uključuju, posebice, neenzimske reakcije oksidacije lipida. U posljednje vrijeme sve se više proširuje proučavanje procesa peroksidacije u lipidnim fazama živih stanica i rasta produkata aktivnih radikala koji narušavaju regulacijske funkcije membrana. Izvor informacija o ovim procesima je i detekcija aktivnih peroksidnih radikala i peroksidnih spojeva biolipida (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; EB Burlakova, 1967 i drugi). Za otkrivanje radikala koristi se biokemoluminiscencija, koja se javlja u lipidima živih stanica tijekom njihove rekombinacije.
Na temelju fizikalno-kemijskih ideja o stabilnosti stacionarnog stanja nastale su biofizičke ideje o prilagodbi biljaka promjenama u uvjetima okoliša kao kršenju inhibitornih antioksidativnih sustava (B.N. Tarusov, Ya.E. Doskoch, B.M. Kitlaev, A.M. Agaverdiev, 1968. - 1972.). To je otvorilo mogućnost procjene svojstava kao što su otpornost na mraz i otpornost na sol, kao i davanje odgovarajućih predviđanja pri uzgoju poljoprivrednih biljaka.
50-ih godina otkrivena je superslaba luminiscencija - biokemoluminiscencija niza bioloških objekata u vidljivom i infracrvenom dijelu spektra (BN Tarusov, AI Zhuravlev, AI Polivoda). To je postalo moguće kao rezultat razvoja metoda za snimanje superslabih svjetlosnih tokova pomoću fotomultiplikatora (L.A. Kubetsky, 1934). Kao rezultat biokemijskih reakcija koje se odvijaju u živoj stanici, biokemoluminiscencija omogućuje prosuđivanje važnih oksidativnih procesa u lancima prijenosa elektrona između enzima. Otkriće i proučavanje biokemoluminiscencije od velike je teorijske i praktične važnosti. Tako BN Tarusov i Yu. B. Kudryashov primjećuju važnu ulogu produkata oksidacije nezasićenih masnih kiselina u mehanizmu nastanka patoloških stanja koja se razvijaju pod utjecajem ionizirajućeg zračenja tijekom karcinogeneze i drugih poremećaja normalnih funkcija stanica.
Pedesetih godina prošlog stoljeća, u vezi s brzim razvojem nuklearne fizike, iz biofizike je nastala radiobiologija koja proučava biološki učinak ionizirajućeg zračenja. Proizvodnja umjetnih radioaktivnih izotopa, stvaranje termonuklearnog oružja, atomskih reaktora i razvoj drugih oblika praktične upotrebe atomske energije vrlo su hitno postavili problem zaštite organizama od štetnog djelovanja ionizirajućeg zračenja, te razvoj teorijskih temelje za prevenciju i liječenje radijacijske bolesti. Da bismo to učinili, prije svega je bilo potrebno otkriti koje su komponente stanice i metaboličke veze najranjivije.
Predmet proučavanja biofizike i radiobiologije bio je rasvjetljavanje prirode primarnih kemijskih reakcija koje nastaju u živim supstratima pod utjecajem energije zračenja. Ovdje je bilo važno ne samo razumjeti mehanizme ovog fenomena, već i moći utjecati na proces izmjene fizičke energije za kemijsku energiju, smanjiti njezin koeficijent "korisnog" djelovanja. Rad u tom smjeru postavio je temelj za proučavanje škole N. N. Semenova (1933.) u SSSR-u i D. Hinshelwooda (1935.) u Engleskoj.
Važno mjesto u radiobiološkim istraživanjima zauzelo je proučavanje stupnja otpornosti na zračenje različitih organizama. Utvrđeno je da je povećana radiootpornost (na primjer, pustinjski glodavci) posljedica visoke antioksidativne aktivnosti lipida staničnih membrana (M. Chang i sur., 1964; NK Ogryzov i sur., 1969). Pokazalo se da tokoferoli, vitamin K i tio spojevi igraju važnu ulogu u formiranju antioksidativnih svojstava ovih sustava (II Ivanov i sur., 1972). Posljednjih godina veliku pozornost privukla su i proučavanja mehanizama mutageneze. U tu svrhu proučava se učinak ionizirajućeg zračenja na ponašanje nukleinskih kiselina i proteina in vitro, kao i kod virusa i faga (A. Gustafson, 1945-1950).
Borba za daljnje povećanje učinkovitosti kemijske zaštite, potraga za učinkovitijim inhibitorima i principima inhibicije ostaju glavni zadaci biofizike u tom smjeru.
Proučavanje pobuđenih stanja biopolimera, koji određuju njihovu visoku kemijsku aktivnost, napredovalo je. Najuspješnije je bilo proučavanje pobuđenih stanja koja nastaju u primarnoj fazi fotobioloških procesa - fotosinteze i vida.
Dakle, dat je značajan doprinos razumijevanju primarne aktivacije molekula biljnih pigmentnih sustava. Utvrđena je velika vrijednost prijenosa (migracije) energije pobuđenih stanja bez gubitaka s aktiviranih pigmenata na druge supstrate. Teorijski radovi A. N. Terenina (1947. i kasnije) odigrali su važnu ulogu u razvoju ovih ideja. AA Krasnovsky (1949) otkrio je i istražio reakciju reverzibilne fotokemijske redukcije klorofila i njegovih analoga. Sada postoji opće uvjerenje da će u bliskoj budućnosti biti moguće reproducirati fotosintezu u umjetnim uvjetima (vidi također 5. poglavlje).
Biofizičari nastavljaju raditi na otkrivanju prirode mišićne kontrakcije i mehanizama uzbuđenja i provođenja živaca (vidi 11. poglavlje). Istraživanja mehanizama prijelaza iz pobuđenog stanja u normalno stanje također su dobila aktualnu važnost. Pobuđeno stanje se sada smatra rezultatom autokatalitičke reakcije, a inhibicija je posljedica oštre mobilizacije inhibitorne antioksidativne aktivnosti kao rezultat molekularnih preuređivanja u spojevima kao što je tokoferol (I.I. Ivanov, O.R. Kols, 1966; O.R. Kols, 1970).
Najvažniji opći problem biofizike ostaje poznavanje kvalitativnih fizikalnih i kemijskih karakteristika žive tvari. Svojstva kao što je sposobnost živih biopolimera da selektivno vežu kalij ili polariziraju električnu struju ne mogu se sačuvati čak ni uz najpažljivije uklanjanje iz tijela. Stoga stanična biofizika nastavlja intenzivno razvijati kriterije i metode za in vivo proučavanje žive tvari.
Unatoč mladosti molekularne biologije, uspjesi koje je postigla na ovom području su uistinu zapanjujući. U relativno kratkom vremenskom razdoblju utvrđena je priroda gena i temeljni principi njegove organizacije, reprodukcije i funkcioniranja. Štoviše, nije provedena samo reprodukcija gena in vitro, već je po prvi put dovršena potpuna sinteza samog gena. Genetski kod je u potpunosti dešifriran i riješen je najvažniji biološki problem specifičnosti biosinteze proteina. Identificirani su i istraženi glavni putovi i mehanizmi stvaranja proteina u stanici. Primarna struktura mnogih transportnih RNA - specifičnih adapterskih molekula koje prevode jezik nukleinskih matrica na jezik aminokiselinskog slijeda sintetiziranog proteina - u potpunosti je određena. Aminokiselinska sekvenca mnogih proteina je u potpunosti dešifrirana, a prostorna struktura nekih od njih je uspostavljena. To je omogućilo pojašnjenje principa i pojedinosti funkcioniranja molekula enzima. Provedena je kemijska sinteza jednog od enzima, ribonukleaze. Utvrđeni su osnovni principi organizacije raznih substaničnih čestica, mnogih virusa i faga, te razotkriveni glavni putovi njihove biogeneze u stanici. Razotkriveni su pristupi razumijevanju načina regulacije aktivnosti gena i rasvjetljavanju regulacijskih mehanizama vitalne aktivnosti. Već jednostavan popis ovih otkrića ukazuje da je druga polovica XX.st. obilježen je golemim napretkom u biologiji, čemu je prije svega zaslužno dubinsko proučavanje strukture i funkcija biološki važnih makromolekula – nukleinskih kiselina i proteina.
Dostignuća molekularne biologije već se koriste u praksi i daju opipljive rezultate u medicini, poljoprivredi i nekim industrijama. Nema sumnje da će se utjecaj ove znanosti povećavati svakim danom. No, glavnim rezultatom ipak treba smatrati da je pod utjecajem uspjeha molekularne biologije ojačano povjerenje u postojanje neograničenih mogućnosti na putu do otkrivanja najintimnijih tajni života.
U budućnosti će se, očito, otkriti novi načini proučavanja biološkog oblika gibanja materije - biologija će prijeći s molekularne razine na atomsku razinu. No, sada, možda, nema niti jednog istraživača koji bi realno mogao predvidjeti razvoj molekularne biologije niti za sljedećih 20 godina.
