Tüüp
Palk
Molekulaarbioloogid uurivad molekulaarprotsesse kui kõigi eluprotsesside alust. Saadud tulemuste põhjal töötavad nad välja kontseptsioonid biokeemiliste protsesside kasutamiseks näiteks meditsiiniuuringutes ja diagnostikas või biotehnoloogias. Lisaks võivad nad olla seotud farmaatsiatoodete valmistamise, tootearenduse, kvaliteedi tagamise või raviminõustamisega.
Molekulaarbioloogid võivad töötada erinevates valdkondades. Näiteks on need seotud uurimistulemuste kasutamisega tootmiseks sellistes valdkondades nagu geenitehnoloogia, valgukeemia või farmakoloogia (ravimite avastamine). Keemia- ja farmaatsiatööstuses hõlbustavad need äsja väljatöötatud toodete juurutamist teadusuuringutest tootmisse, tooteturundusse ja kasutajate nõustamisse.
Teaduslikes uuringutes uurivad molekulaarbioloogid orgaaniliste ühendite keemilisi ja füüsikalisi omadusi, samuti keemilisi protsesse (rakkude ainevahetuse vallas) elusorganismides ning avaldavad uuringute tulemused. Kõrgkoolides õpetavad nad tudengeid, valmistuvad loenguteks ja seminarideks, kontrollivad kirjalikke töid ja sooritavad eksameid. Iseseisev teaduslik tegevus on võimalik alles pärast magistrikraadi ja doktorikraadi omandamist.
Molekulaarbioloogid leiavad töökohti nagu
Saksamaal molekulaarbioloogide palk on
(erinevate Saksamaa statistikaametite ja tööhõiveteenistuste andmetel)
Molekulaarbioloogid uurivad molekulaarprotsesse kui kõigi eluprotsesside alust. Saadud tulemuste põhjal töötavad nad välja kontseptsioonid biokeemiliste protsesside kasutamiseks näiteks meditsiiniuuringutes ja diagnostikas või biotehnoloogias. Lisaks võivad nad olla seotud farmaatsiatoodete valmistamise, tootearenduse, kvaliteedi tagamise või raviminõustamisega.
Molekulaarbioloogia ehk molekulaargeneetika tegeleb nukleiinhapete struktuuri ja biosünteesi uurimisega ning selle informatsiooni edastamise ja rakendamisega valkude kujul seotud protsessidega. See võimaldab mõista nende funktsioonide valusaid häireid ja võimalusel neid geeniteraapiaga ravida. Biotehnoloogia ja geenitehnoloogia jaoks on olemas liidesed, mille käigus luuakse lihtsaid organisme, nagu bakterid ja pärm, et muuta farmakoloogilist või kaubanduslikku huvi pakkuvad ained sihitud mutatsioonide kaudu kaubanduslikult kättesaadavaks.
Farmaatsia- ja keemiatööstus pakub molekulaarbioloogidele mitmeid töövaldkondi. Tööstuslikus keskkonnas analüüsivad nad biotransformatsiooniprotsesse või arendavad ja täiustavad protsesse toimeainete ja farmatseutiliste vahesaaduste mikrobioloogiliseks tootmiseks. Lisaks tegelevad nad äsja arendatud toodete üleminekuga uurimistööst tootmisse. Kontrollimisülesannete kaudu tagavad nad, et tootmisrajatised, seadmed, analüüsimeetodid ja kõik tundlike toodete (nt ravimid) tootmise etapid vastavad alati nõutavatele kvaliteedistandarditele. Lisaks nõustavad molekulaarbioloogid kasutajaid uute toodete kasutamisel.
Juhtivate ametikohtade jaoks on sageli vaja magistriprogrammi.
Teaduse ja uurimistöö valdkonnas tegelevad molekulaarbioloogid selliste teemadega nagu valkude äratundmine, transport, voltimine ja kodifitseerimine rakus. Uurimistulemused, mis on aluseks praktilisele rakendamisele erinevates valdkondades, avaldatakse ja tehakse seeläbi kättesaadavaks teistele teadlastele ja üliõpilastele. Konverentsidel ja kongressidel arutatakse ja tutvustatakse teadustegevuse tulemusi. Molekulaarbioloogid peavad loenguid ja seminare, suunavad teadustööd ja sooritavad eksameid.
Iseseisev teadustegevus eeldab magistri- ja doktorikraadi.
1. Sissejuhatus.
Molekulaarbioloogia ja geneetika õppeaine, ülesanded ja meetodid. "Klassikalise" geneetika ja mikroorganismide geneetika väärtus molekulaarbioloogia ja geenitehnoloogia arengus. Geeni mõiste "klassikalises" ja molekulaargeneetikas, selle evolutsioon. Geenitehnoloogia metoodika panus molekulaargeneetika arengusse. Geenitehnoloogia rakendusväärtus biotehnoloogia jaoks.
2. Pärilikkuse molekulaarne alus.
Raku mõiste, selle makromolekulaarne koostis. Geneetilise materjali olemus. DNA geneetilise funktsiooni tõendite ajalugu.
2.1. Erinevat tüüpi nukleiinhapped. Nukleiinhapete bioloogilised funktsioonid. Nukleiinhapete keemiline struktuur, ruumiline struktuur ja füüsikalised omadused. Pro- ja eukarüootide geneetilise materjali struktuuri tunnused. Täiendavad Watson-Cricki aluspaarid. Geneetiline kood. Geneetilise koodi dekodeerimise ajalugu. Koodi peamised omadused: kolmik, kood ilma komadeta, degeneratsioon. Koodisõnastiku tunnused, koodonite perekonnad, semantilised ja "mõttetu" koodonid. Ringikujulised DNA molekulid ja DNA ülikerimise kontseptsioon. DNA topoisomeerid ja nende tüübid. Topoisomeraaside toimemehhanismid. Bakterite DNA güraas.
2.2. DNA transkriptsioon. Prokarüootide RNA polümeraas, selle allüksus ja kolmemõõtmelised struktuurid. Erinevad sigmafaktorid. Prokarüootse geeni promootor, selle struktuurielemendid. Transkriptsioonitsükli etapid. Transkriptsiooni initsiatsioon, "avatud kompleksi" moodustumine, pikenemine ja lõpetamine. Transkriptsiooni nõrgenemine. Trüptofaani operoni ekspressiooni reguleerimine. "Ribo lülitid". Transkriptsiooni lõpetamise mehhanismid. Transkriptsiooni negatiivne ja positiivne regulatsioon. Laktoosi operon. Transkriptsiooni reguleerimine lambda faagi arengus. Reguleerivate valkude (CAP-valgu ja lambda-faagi repressori) DNA äratundmise põhimõtted. Transkriptsiooni tunnused eukarüootides. RNA töötlemine eukarüootides. Transkriptide piiramine, splaissimine ja polüadenüülimine. Ühendusmehhanismid. Väikeste tuuma-RNA-de ja valgufaktorite roll. Alternatiivne splaissimine, näited.
2.3. Saade, selle etapid, ribosoomide funktsioon. Ribosoomide lokaliseerimine rakus. Prokarüootsed ja eukarüootsed ribosoomide tüübid; 70S ja 80S ribosoomid. Ribosoomide morfoloogia. Jaotus alamosakesteks (alaühikuteks). Koodonist sõltuv aminoatsüül-tRNA seondumine elongatsioonitsüklis. Koodon-antikoodon interaktsioon. Elongatsioonifaktori EF1 (EF-Tu) osalus aminoatsüül-tRNA seondumisel ribosoomiga. Elongatsioonitegur EF1B (EF-Ts), selle funktsioon, reaktsioonide jada selle osalusel. Antibiootikumid, mis mõjutavad aminoatsüül-tRNA ribosoomiga koodonist sõltuva seondumise etappi. Aminoglükosiidide antibiootikumid (streptomütsiin, neomütsiin, kanamütsiin, gentamütsiin jt), nende toimemehhanism. Tetratsükliinid kui aminoatsüül-tRNA ribosoomiga seondumise inhibiitorid. Saate algatamine. Algatamisprotsessi peamised etapid. Translatsiooni initsiatsioon prokarüootides: initsiatsioonifaktorid, initsiatsioonikoodonid, väikese ribosomaalse subühiku RNA 3-ots ja Shine-Dalgarno järjestus mRNA-s. Translatsiooni initsiatsioon eukarüootides: initsiatsioonifaktorid, initsiatsioonikoodonid, 5 ¢ transleerimata piirkond ja korgist sõltuv "terminaalne" initsiatsioon. "Sisemine" korgist sõltumatu initsiatsioon eukarüootides. Transpeptidatsioon. Transpeptidatsiooni inhibiitorid: klooramfenikool, linkomütsiin, amütsetiin, streptogramiinid, anisomütsiin. Translokatsioon. Pikendusteguri EF2 (EF-G) ja GTP kaasamine. Translokatsiooni inhibiitorid: fusidiinhape, viomütsiin, nende toimemehhanismid. Saate lõpetamine. Lõpetuskoodonid. Prokarüootide ja eukarüootide valgu terminatsioonifaktorid; kahte tüüpi lõpetamisfaktoreid ja nende toimemehhanisme. Tõlke reguleerimine prokarüootides.
2.4. DNA replikatsioon ja selle geneetiline kontroll. Replikatsioonis osalevad polümeraasid, nende ensümaatilise aktiivsuse omadused. DNA reprodutseerimise täpsus. DNA aluspaaride vaheliste steeriliste interaktsioonide roll replikatsiooni ajal. E. coli polümeraasid I, II ja III. Polümeraas III subühikud. Replikatsiooni kahvel, juhtlõime ja viivituslõime replikatsioonis. Okazaki killud. Valkude kompleks replikatsioonikahvlis. Replikatsiooni initsiatsiooni reguleerimine E. coli's. Replikatsiooni lõpetamine bakterites. Plasmiidi replikatsiooni reguleerimise tunnused. Kahesuunaline ja veerev rõnga replikatsioon.
2.5. Rekombinatsioon, selle tüübid ja mudelid. Üldine või homoloogne rekombinatsioon. Kaheahelaline DNA katkeb, käivitades rekombinatsiooni. Rekombinatsiooni roll kaheahelaliste katkestuste replikatiivses parandamises. Holliday struktuur rekombinatsioonimudelis. Üldise rekombinatsiooni ensümoloogia E. coli's. RecBCD kompleks. RecA valk. Rekombinatsiooni roll DNA sünteesi tagamisel replikatsiooni katkestava DNA kahjustuse korral. Rekombinatsioon eukarüootides. Rekombinatsiooniensüümid eukarüootides. Saidispetsiifiline rekombinatsioon. Üldise ja kohaspetsiifilise rekombinatsiooni molekulaarsete mehhanismide erinevused. Rekombinaasi klassifikatsioon. Kohaspetsiifilise rekombinatsiooni käigus läbi viidud kromosomaalsete ümberkorralduste tüübid. Kohaspetsiifilise rekombinatsiooni regulatiivne roll bakterites. Mitmerakuliste eukarüootide kromosoomide konstrueerimine kohaspetsiifilise faagi rekombinatsioonisüsteemi abil.
2.6. DNA parandamine. Remonditüüpide klassifikatsioon. Tümiini dimeeride ja metüülitud guaniini otsene parandamine. Aluste välja lõikamine. Glükosülaas. Paaritute nukleotiidide parandamise mehhanism (mittevastavuse parandamine). Parandatava DNA ahela valik. SOS remont. SOS-i parandamisel osalevate DNA polümeraaside omadused prokarüootides ja eukarüootides. Mõiste "adaptiivsed mutatsioonid" bakterites. Kaheahelaliste katkestuste parandamine: homoloogne replikatsioonijärgne rekombinatsioon ja DNA molekuli mittehomoloogsete otste liitmine. Seos replikatsiooni, rekombinatsiooni ja parandamise protsesside vahel.
3. Mutatsiooniprotsess.
Biokeemiliste mutantide roll ühe geeni moodustamisel – ühe ensüümi teooria. Mutatsioonide klassifikatsioon. Punktmutatsioonid ja kromosoomide ümberkorraldused, nende tekkemehhanism. Spontaanne ja indutseeritud mutagenees. Mutageenide klassifikatsioon. Mutageneesi molekulaarne mehhanism. Mutageneesi ja parandamise vaheline seos. Mutantide identifitseerimine ja valik. Supressioon: intrageenne, intergeenne ja fenotüübiline.
4. Ekstrakromosomaalsed geneetilised elemendid.
Plasmiidid, nende struktuur ja klassifikatsioon. Seksuaalfaktor F, selle struktuur ja elutsükkel. Faktori F roll kromosomaalse ülekande mobiliseerimisel. Doonorite nagu Hfr ja F " moodustumine. Konjugatsiooni mehhanism. Bakteriofaagid, nende struktuur ja elutsükkel. Virulentsed ja mõõdukad bakteriofaagid. Lüsogenees ja transduktsioon. Üldine ja spetsiifiline transduktsioon. Rändavad geneetilised elemendid: transposoonid ja IS-järjestused, nende roll geneetilises vahetuses DNA -transposoonid prokarüootide ja eukarüootide genoomides Bakterite IS-järjestused, nende struktuur IS-järjestused bakterite F-faktori komponendina, mis määrab konjugatsiooni käigus geneetilise materjali ülekandmise võime Bakterite ja eukarüootsete organismide transposoonid Otsene transpositsioonide mittereplikatiivsed ja replikatiivsed mehhanismid Transposoonide horisontaalse ülekande kontseptsioon ja nende roll struktuursetes ümberkorraldustes (ektoopiline rekombinatsioon) ja genoomi evolutsioonis.
5. Geeni ehituse ja talitluse uurimine.
Geneetilise analüüsi elemendid. Cis-trans komplementatsiooni test. Geneetiline kaardistamine konjugatsiooni, transduktsiooni ja transformatsiooni abil. Geneetiliste kaartide koostamine. Peen geneetiline kaardistamine. Geeni struktuuri füüsikaline analüüs. Heterodupleksanalüüs. Piirangute analüüs. Järjestusmeetodid. Polümeraasi ahelreaktsioon. Geeni funktsiooni tuvastamine.
6. Geeniekspressiooni reguleerimine. Operoni ja Reguloni mõisted. Kontroll transkriptsiooni initsiatsiooni tasemel. Promootor-, operaator- ja reguleerivad valgud. Geeniekspressiooni positiivne ja negatiivne kontroll. Kontroll transkriptsiooni lõpetamise tasemel. Kataboliidiga juhitavad operonid: laktoosi, galaktoosi, arabinoosi ja maltoosi operonite mudelid. Atenuaatoriga juhitavad operonid: trüptofaani operoni mudel. Geeniekspressiooni multivalentne reguleerimine. Globaalsed reguleerimissüsteemid. Regulatiivne reaktsioon stressile. Transkriptsioonijärgne kontroll. Sigali transduktsioon. RNA-vahendatud regulatsioon: väikesed RNA-d, sensoorsed RNA-d.
7. Geenitehnoloogia alused. Restriktsiooni- ja modifikatsiooniensüümid. Geenide isoleerimine ja kloonimine. Vektorid molekulaarseks kloonimiseks. Rekombinantse DNA konstrueerimise ja retsipientrakkudesse viimise põhimõtted. Geenitehnoloogia rakenduslikud aspektid.
1. Watson J., Ace J., Rekombinantne DNA: lühike kursus. - M .: Mir, 1986.
2. Geenid. - M .: Mir. 1987.
3. Molekulaarbioloogia: nukleiinhapete struktuur ja biosüntees. / Toim. ... - M. Kõrgkool. 1990. aasta.
4., - Molekulaarbiotehnoloogia. M. 2002.
5. Spiriini ribosoomid ja valkude biosüntees. - M .: Kõrgkool, 1986.
1. Genoomi Khesin. - M .: Teadus. 1984. aasta.
2. Rybchini geenitehnoloogia. - SPb .: SPbSTU. 1999. aastal.
3. Geenide Patrušev. - M .: Nauka, 2000.
4. Kaasaegne mikrobioloogia. Prokarüootid (2 mahus). - M .: Mir, 2005.
5. M. Singer, P. Berg. Geenid ja genoomid. - M .: Mir, 1998.
6. Pähklipurejate tehnika. - Novosibirsk: Sibist. Ülikool, 2004.
7. Stepanovi bioloogia. Valkude struktuur ja funktsioon. - M .: V. Sh., 1996.
Molekulaarbioloogia / m ə lɛ ToJʊ lər / on bioloogia haru, mis käsitleb biomolekulide vahelise bioloogilise aktiivsuse molekulaarseid aluseid erinevates rakusüsteemides, sealhulgas DNA, RNA, valkude ja nende biosünteesi vahelisi interaktsioone, samuti nende interaktsioonide reguleerimist. Sisse registreerimine loodus 1961. aastal kirjeldas Astbury molekulaarbioloogiat:
Mitte niivõrd tehnika, kuivõrd lähenemine, lähenemine nn fundamentaalteaduste vaatenurgast, mille juhtmõtteks on otsida vastavat molekulaarplaani klassikalise bioloogia laiaulatuslike ilmingute alt. See puudutab eelkõige vormid bioloogilised molekulid ja [...] valdavalt kolmemõõtmelised ja struktuursed – mis aga ei tähenda, et tegemist oleks vaid morfoloogia täpsustusega. Ta peab samal ajal uurima tekke ja funktsiooni.
Molekulaarbioloogia valdkonna teadlased kasutavad spetsiifilisi molekulaarbioloogia kasvatamise meetodeid, kuid üha enam kombineerivad neid geneetikast ja biokeemiast pärit meetodite ja ideedega. Nende distsipliinide vahel pole kindlat piiri. Seda illustreerib järgmine diagramm, mis kujutab üht võimalikku väljadevahelist seost:
Üks põhilisemaid molekulaarbioloogia meetodeid valgu funktsioonide uurimiseks on molekulaarne kloonimine. Selle tehnika puhul kloonitakse huvipakkuvat valku kodeeriv DNA polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) ja/või restriktsiooniensüümide abil plasmiidis (ekspressioonivektoris). Vektoril on 3 iseloomulikku tunnust: replikatsiooni alguspunkt, mitme kloonimissait (MCS) ja selektsioonimarker, mis on tavaliselt antibiootikumiresistentne. Ülesvoolu mitmed kloonimissaidid on promootorpiirkonnad ja transkriptsiooni initsiatsioonisaidid, mis reguleerivad kloonitud geeni ekspressiooni. Seda plasmiidi saab sisestada kas bakteri- või loomarakkudesse. DNA sisestamine bakterirakkudesse võib toimuda transformatsiooniga, kasutades palja DNA omastamist, konjugeerimisega, kasutades raku-raku kontakte, või transduktsiooniga, kasutades viirusvektorit. DNA sisestamist eukarüootsetesse rakkudesse, näiteks loomarakkudesse füüsikaliste või keemiliste vahenditega, nimetatakse transfektsiooniks. Saadaval on mitu erinevat transfektsioonimeetodit, nagu kaltsiumfosfaadi transfektsioon, elektroporatsioon, mikroinjektsioon ja liposomaalne transfektsioon. Plasmiidi saab integreerida genoomi, mille tulemuseks on stabiilne transfektsioon, või see võib jääda genoomist sõltumatuks, mida nimetatakse mööduvaks transfektsiooniks.
Huvipakkuvaid valke kodeeriv DNA on nüüd rakus ja valke saab nüüd ekspresseerida. Erinevad süsteemid, nagu indutseeritavad promootorid ja spetsiifilised rakulised signaaliülekandefaktorid, aitavad väljendada valkude huvi kõrgel tasemel. Seejärel saab bakteri- või eukarüootsest rakust kätte saada suures koguses valku. Valgu ensümaatilist aktiivsust saab testida erinevates olukordades, valku saab kristalliseerida, et uurida selle tertsiaarset struktuuri või farmaatsiatööstuses uute ravimite aktiivsust valgu vastu.
Tingimused põhjapoolne , läänes ja idamaine blotting saab algselt molekulaarbioloogiast nalja, mida selle terminiga mängiti Southernnet, järgides Edwin Southerni poolt BLOTTED DNA hübridisatsiooni jaoks kirjeldatud protseduuri. Patricia Thomas, RNA blotimise arendaja, mis seejärel sai tuntuks kui north - blotting, ära kasuta seda terminit.
Selle leiutaja, bioloog Edwin Southi järgi nime saanud Southern blot on meetod konkreetse DNA järjestuse olemasolu uurimiseks DNA proovis. DNA proovid enne või pärast restriktsiooniensüümi (restriktsiooniensüümi) lõhustamist eraldatakse geelelektroforeesiga ja kantakse seejärel membraanile, kasutades kapillaartegevust. Seejärel eksponeeritakse membraan märgistatud DNA sondiga, mille alusjärjestus on komplementaarne huvipakkuva DNA omaga. Southern blottingut kasutatakse teaduslaboris vähem laialdaselt, kuna teised meetodid, näiteks PCR, suudavad tuvastada DNA proovidest spetsiifilisi DNA järjestusi. Neid blotte kasutatakse siiski mõnes rakenduses, näiteks transgeeni koopiate arvu mõõtmiseks transgeensetel hiirtel või väljalülitatud embrüonaalsete tüvirakuliinide geenitehnoloogias.
Northern blot diagramm
Kliinilised uuringud ja molekulaarbioloogiast tulenevad meditsiinilised teraapiad on osaliselt kaetud geeniteraapiaga. Molekulaarbioloogia või molekulaarrakubioloogia lähenemisviiside rakendamist meditsiinis nimetatakse tänapäeval molekulaarmeditsiiniks. Molekulaarbioloogial on oluline roll ka erinevate rakuosade moodustumise, toimimise ja regulatsiooni mõistmisel, mida saab kasutada uute ravimite tõhusaks sihtimiseks, haiguste diagnoosimiseks ja rakufüsioloogia mõistmiseks.
Molekulaarbioloogia on kogenud oma uurimismeetodite kiire arengu perioodi, mis eristab seda nüüd biokeemiast. Nende hulka kuuluvad eelkõige geenitehnoloogia, kloonimise, kunstliku ekspressiooni ja geenide väljalülitamise meetodid. Kuna DNA on geneetilise informatsiooni materiaalne kandja, siis on molekulaarbioloogia muutunud geneetikale palju lähedasemaks ning ristmikul tekkis molekulaargeneetika, mis on nii geneetika kui ka molekulaarbioloogia haru. Nii nagu molekulaarbioloogias kasutatakse laialdaselt viirusi uurimisvahendina, kasutatakse viroloogias nende probleemide lahendamiseks molekulaarbioloogia meetodeid. Geneetilise informatsiooni analüüsiks on kaasatud arvutitehnoloogia, millega seoses on tekkinud uued molekulaargeneetika suunad, mida mõnikord peetakse ka eridistsipliinideks: bioinformaatika, genoomika ja proteoomika.
Selle fundamentaalse avastuse valmistas ette pikk viiruste ja bakterite geneetika ja biokeemia uurimise etapp.
1928. aastal näitas Frederick Griffith esimest korda, et kuumusega tapetud patogeensete bakterite ekstrakt võib edastada patogeensuse mitteohtlikele bakteritele. Bakterite transformatsiooni uurimine viis hiljem patogeense aine puhastamiseni, mis vastupidiselt ootustele osutus mitte valguks, vaid nukleiinhappeks. Iseenesest ei ole nukleiinhape ohtlik, ta kannab edasi ainult geene, mis määravad mikroorganismi patogeensuse ja muud omadused.
XX sajandi 50ndatel näidati, et bakteritel on primitiivne seksuaalprotsess, nad on võimelised vahetama kromosomaalset DNA-d, plasmiide. Plasmiidide avastamine, nagu transformatsioon, oli molekulaarbioloogias laialt levinud plasmiiditehnoloogia aluseks. Teine oluline metoodika avastus oli bakteriaalsete viiruste ja bakteriofaagide avastamine 20. sajandi alguses. Faagid võivad kanda ka geneetilist materjali ühest bakterirakust teise. Bakterite nakatumine faagidega põhjustab bakteri RNA koostise muutumise. Kui ilma faagideta on RNA koostis sarnane bakteriaalse DNA koostisega, siis pärast nakatumist muutub RNA sarnasemaks bakteriofaagi DNA-ga. Seega leiti, et RNA struktuuri määrab DNA struktuur. Valkude sünteesi kiirus rakkudes omakorda sõltub RNA-valgu komplekside hulgast. Nii see sõnastati Molekulaarbioloogia keskne dogma: DNA ↔ RNA → valk.
Molekulaarbioloogia edasise arenguga kaasnes nii selle metoodika väljatöötamine, eelkõige DNA nukleotiidjärjestuse määramise meetodi leiutamine (W. Gilbert ja F. Senger, Nobeli keemiaauhind, 1980), kui ka uued. avastused geenide ehituse ja funktsioneerimise uuringute vallas (vt. Geneetika ajalugu). 21. sajandi alguseks saadi andmeid kogu inimese DNA algstruktuuri ja mitmete teiste meditsiini, põllumajanduse ja teadusuuringute jaoks kõige olulisemate organismide kohta, mis tõi kaasa mitme uue bioloogia suuna: genoomika tekkimise. , bioinformaatika jne.
Wikimedia sihtasutus. 2010. aasta.
MOLEKULAARBIOLOOGIA- õpib DOS-i. elu omadused ja ilmingud molekulaarsel tasandil. Olulisemad suunad M. b. on uuringud rakkude geneetilise aparaadi struktuurse ja funktsionaalse korralduse ning päriliku teabe realiseerimise mehhanismi kohta ... ... Bioloogia entsüklopeediline sõnastik
MOLEKULAARBIOLOOGIA- uurib elu põhiomadusi ja ilminguid molekulaarsel tasandil. Saab teada, kuidas ja mil määral on organismide kasv ja areng, päriliku informatsiooni talletamine ja edasiandmine, energia muundumine elusrakkudes jne nähtused tingitud ... Suur entsüklopeediline sõnaraamat
MOLEKULAARBIOLOOGIA Kaasaegne entsüklopeedia
MOLEKULAARBIOLOOGIA- MOLEKULAARBIOLOOGIA, elusorganisme moodustavate Molekulide ehituse ja toimimise bioloogiline uurimine. Peamised uurimisvaldkonnad on valkude ja NUKLEEHAPETE, näiteks DNA, füüsikalised ja keemilised omadused. Vaata ka… … Teaduslik ja tehniline entsüklopeediline sõnastik
molekulaarbioloogia- osa biol., mis uurib elu põhiomadusi ja ilminguid molekulaarsel tasandil. Saab teada, kuidas ja mil määral toimub organismide kasv ja areng, päriliku informatsiooni talletamine ja edastamine, energia muundumine elusrakkudes ja ... ... Mikrobioloogia sõnaraamat
molekulaarbioloogia- - Biotehnoloogia teemad EN molekulaarbioloogia ... Tehniline tõlkija juhend
Molekulaarbioloogia- MOLEKULAARBIOLOOGIA, uurib elu põhiomadusi ja ilminguid molekulaarsel tasandil. Saab teada, kuidas ja mil määral toimub organismide kasv ja areng, päriliku informatsiooni talletamine ja edastamine, energia muundumine elusrakkudes ja ... ... Illustreeritud entsüklopeediline sõnaraamat
Molekulaarbioloogia- teadus, mis seab oma ülesandeks elutegevuse nähtuste olemuse tundmise, uurides bioloogilisi objekte ja süsteeme molekulaarsele tasemele läheneval, mõnel juhul isegi selle piirini jõudval tasemel. Lõppeesmärk selles ...... Suur Nõukogude entsüklopeedia
MOLEKULAARBIOLOOGIA- uurib elunähtusi makromolekulide tasemel (hl. obr. valgud ja nukleiinhape) rakulistes struktuurides (ribosoomid jne), viirustes, aga ka rakkudes. M. värav. nende makromolekulide rolli ja toimimismehhanismi kindlaksmääramine, mis põhineb ... ... Keemia entsüklopeedia
molekulaarbioloogia- uurib elu põhiomadusi ja ilminguid molekulaarsel tasandil. Saab teada, kuidas ja mil määral toimub organismide kasv ja areng, päriliku teabe talletamine ja edastamine, energia muundumine elusrakkudes ja muud nähtused ... ... entsüklopeediline sõnaraamat
Nukleiinhapete ja valkude biosünteesi uurimise edusammud on viinud mitmete meetodite loomiseni, millel on suur rakenduslik tähtsus meditsiinis, põllumajanduses ja paljudes teistes tööstusharudes.
Pärast geneetilise koodi ning päriliku teabe säilitamise ja realiseerimise põhiprintsiipide uurimist jõudis molekulaarbioloogia areng ummikusse, kuna puudusid meetodid, mis saaksid geenidega manipuleerida, neid isoleerida ja muuta. Nende meetodite esilekerkimine toimus 1970. ja 1980. aastatel. See andis võimsa tõuke selle tänaseni õitseva teadusvaldkonna arengule. Esiteks puudutavad need meetodid üksikute geenide tootmist ja nende viimist teiste organismide rakkudesse (molekulaarne kloonimine ja transgenees, PCR), samuti geenides nukleotiidide järjestuse määramise meetodeid (DNA ja RNA järjestuse määramine). Neid meetodeid käsitletakse üksikasjalikumalt allpool. Alustame lihtsaimast põhimeetodist, elektroforeesist, ja seejärel liigume edasi arenenumate meetodite juurde.
See on põhiline DNA tehnika, mida kasutatakse koos peaaegu kõigi teiste meetoditega soovitud molekulide eraldamiseks ja tulemuste analüüsimiseks. DNA fragmentide eraldamiseks pikkuse järgi kasutatakse geelelektroforeesi meetodit. DNA on hape, selle molekulid sisaldavad fosforhappe jääke, mis lõhustavad prootoni ja omandavad negatiivse laengu (joonis 1).
Seetõttu liiguvad elektriväljas DNA molekulid anoodile – positiivselt laetud elektroodile. See toimub elektrolüüdi lahuses, mis sisaldab laengukandjate ioone, nii et see lahus juhib voolu. Fragmentide eraldamiseks kasutatakse tihedat polümeergeeli (agaroos või polüakrüülamiid). Mida rohkem DNA molekule sellesse "põimuvad", seda pikemad nad on ja seetõttu liiguvad pikimad molekulid kõige aeglasemalt ja lühemad - kõige kiiremini (joonis 2). Enne või pärast elektroforeesi töödeldakse geeli värvainetega, mis seonduvad DNA-ga ja fluorestseeruvad ultraviolettvalguses, ning saadakse geelis olevate ribade muster (vt joonis 3). Proovi DNA fragmentide pikkuste määramiseks võrreldakse neid markeriga – standardpikkusega fragmentide komplektiga, mida kantakse paralleelselt samale geelile (joonis 4).
DNA-ga töötamise kõige olulisemad vahendid on ensüümid, mis transformeerivad DNA-d elusrakkudes: DNA polümeraasid, DNA ligaasid ja restriktsiooniendonukleaasid ehk restriktsiooniensüümid. DNA polümeraas viia läbi DNA maatrikssünteesi, mis võimaldab DNA-d katseklaasis paljundada. DNA ligaasidõmble kokku DNA molekule või parandab neis olevaid lünki. Restriktsiooni endonukleaasid, või restriktsiooniensüümid, lõigake DNA molekulid rangelt määratletud järjestuste järgi, mis võimaldab teil DNA kogumassist üksikuid fragmente välja lõigata. Need fragmendid võivad mõnel juhul sisaldada eraldi geene.
Restriktsiooniendonukleaaside poolt äratuntavad järjestused on sümmeetrilised ja katkestused võivad tekkida sellise järjestuse keskel või nihkega (mõlemas DNA ahelas samas kohas). Erinevat tüüpi restriktsiooniensüümide toimeskeem on näidatud joonisel fig. 1. Esimesel juhul saadakse nn "nürid" otsad ja teisel "kleepuvad" otsad. Põhja "kleepuvate" otste korral osutub kett teisest lühemaks, moodustatakse üheahelaline osa, mille mõlemas otsas on identne sümmeetriline järjestus.
Terminaalsed järjestused on samad, kui mis tahes DNA lõigatakse antud restriktsiooniensüümiga ja neid saab uuesti siduda, kuna neil on komplementaarsed järjestused. Neid saab DNA ligaasi kasutades kokku õmmelda ja saada üks molekul. Seega on võimalik kombineerida kahe erineva DNA fragmente ja saada nn rekombinantne DNA... Seda lähenemist kasutatakse molekulaarse kloonimise meetodis, mis võimaldab hankida üksikuid geene ja viia need rakkudesse, mis võivad moodustada geenis kodeeritud valku.
Molekulaarses kloonimises kasutatakse kahte DNA molekuli – huvipakkuvat geeni sisaldavat inserti ja vektor- DNA, mis toimib kandjana. Insert "õmmeldakse" vektorisse, kasutades ensüüme, et saada uus rekombinantne DNA molekul, seejärel viiakse see molekul peremeesrakkudesse ja need rakud moodustavad toitainekeskkonnas kolooniaid. Koloonia on ühe raku järglane, see tähendab kloon, kõik koloonia rakud on geneetiliselt identsed ja sisaldavad sama rekombinantset DNA-d. Sellest ka mõiste "molekulaarne kloonimine", st meile huvipakkuvat DNA fragmenti sisaldava rakkude klooni saamine. Pärast meile huvipakkuvat inserti sisaldavate kolooniate saamist on võimalik seda inserti iseloomustada erinevate meetoditega, näiteks määrata selle täpne järjestus. Rakud võivad toota ka insertiga kodeeritud valku, kui see sisaldab funktsionaalset geeni.
Kui rakkudesse sisestatakse rekombinantne molekul, toimub nende rakkude geneetiline transformatsioon. Muutumine- organismi raku poolt keskkonnast vaba DNA molekuli imendumise ja genoomi sisseviimise protsess, mille tulemusena ilmnevad sellises rakus DNA doonororganismile iseloomulikud uued pärilikud tunnused. Näiteks kui sisestatud molekul sisaldab antibiootikumi ampitsilliini suhtes resistentsuse geeni, siis transformeeritud bakterid kasvavad selle juuresolekul. Enne transformatsiooni põhjustas ampitsilliin nende surma, see tähendab, et transformeeritud rakkudes ilmneb uus tunnus.
Vektoril peab olema mitmeid omadusi:
Esiteks on see suhteliselt väike DNA molekul, mida on lihtne manipuleerida.
Teiseks, selleks, et DNA rakus säiliks ja paljuneks, peab see sisaldama kindlat järjestust, mis tagab selle replikatsiooni (replikatsiooni alguspunkt ehk replikatsiooni alguspunkt).
Kolmandaks peab see sisaldama geenimarker, mis tagab ainult nende rakkude valiku, millesse vektor on langenud. Tavaliselt on need antibiootikumiresistentsuse geenid – siis surevad antibiootikumi juuresolekul kõik rakud, mis vektorit ei sisalda.
Geenide kloonimine toimub kõige sagedamini bakterirakkudes, kuna neid on lihtne kasvatada ja paljuneda kiiresti. Bakterirakk sisaldab tavaliselt ühte suurt ringikujulist, mitme miljoni nukleotiidipaari pikkust DNA molekuli, mis sisaldab kõiki bakteritele vajalikke geene – bakterikromosoomi. Lisaks sellele on mõnes bakteris väike (mitu tuhat aluspaari) ringikujuline DNA nn plasmiidid(joon. 2). Need, nagu põhiline DNA, sisaldavad nukleotiidide järjestust, mis tagavad DNA replikatsioonivõime (ori). Plasmiidid replitseerivad peamisest (kromosomaalsest) DNA-st sõltumatult, seetõttu esinevad nad rakus suure hulga koopiatena. Paljud neist plasmiididest kannavad antibiootikumiresistentsuse geene, et eristada plasmiidi kandvaid rakke normaalsetest rakkudest. Enamasti kasutatakse plasmiide, mis kannavad kahte geeni, mis tagavad resistentsuse kahe antibiootikumi, näiteks tetratsükliini ja amitsilliini suhtes. Selliste plasmiidsete DNA-de eraldamiseks, mis on vabad bakteri põhikromosoomi DNA-st, on olemas lihtsad meetodid.
Geenide ülekandumist ühest organismist teise nimetatakse transgenees ja sellised muundatud organismid - transgeensed... Geenide ülekandmisel mikroorganismide rakkudesse saadakse meditsiiniliste vajaduste jaoks rekombinantsed valgupreparaadid, eelkõige inimese valgud, mis ei põhjusta immuunsüsteemi äratõukereaktsiooni - interferoonid, insuliin ja muud proteiinhormoonid, raku kasvufaktorid, aga ka valgu jaoks mõeldud valgud. vaktsiinide tootmine. Keerulisematel juhtudel, kui valkude modifitseerimine kulgeb õigesti ainult eukarüootsetes rakkudes, kasutatakse transgeenseid rakukultuure või transgeenseid loomi, eelkõige kariloomi (peamiselt kitsesid), kes eritavad vajalikke valke piima või eraldatakse valke nende verest. . Nii saadakse antikehad, hüübimisfaktorid ja muud valgud. Transgeneesi meetodil saadakse põllukultuurid, mis on resistentsed herbitsiidide ja kahjurite suhtes ning millel on muid kasulikke omadusi. Transgeensete mikroorganismide abil puhastavad nad reovett ja võitlevad reostusega, leidub isegi transgeenseid mikroobe, mis suudavad õli lagundada. Lisaks on transgeensed tehnoloogiad teadusuuringutes asendamatud – bioloogia areng pole tänapäeval mõeldav ilma modifikatsiooni- ja geenisiirdemeetodite rutiinse kasutamiseta.
molekulaarse kloonimise tehnoloogia
Individuaalse geeni saamiseks mis tahes organismist eraldatakse sellest kogu kromosomaalne DNA ja lõigatakse see ühe või kahe restriktsiooniensüümiga. Ensüümid valitakse nii, et nad ei lõikaks meile huvipakkuvat geeni, vaid teeksid katkestusi piki selle servi ja teeksid 1 katkestuse plasmiidses DNA-s ühes resistentsusgeenis, näiteks ampitsilliini suhtes.
Molekulaarse kloonimise protsess hõlmab järgmisi samme:
Lõikamine ja õmblemine - ühe rekombinantse molekuli konstrueerimine inserdist ja vektorist.
Transformatsioon on rekombinantse molekuli viimine rakkudesse.
Valik – insertivektori saanud rakkude valimine.
Plasmiidset DNA-d töödeldakse samade restriktsiooniensüümidega ja see muundatakse lineaarseks molekuliks, kui valitakse selline restriktsiooniensüüm, mis lisab plasmiidi 1 tühimiku. Selle tulemusena on kõigi saadud DNA fragmentide otsad samad kleepuvad. Kui temperatuur on langetatud, ühendatakse need otsad juhuslikult ja ligeeritakse DNA ligaasiga (vt joonis 3).
Saadakse erineva koostisega ringikujuliste DNA-de segu: mõned neist sisaldavad spetsiifilist kromosomaalse DNA DNA järjestust, mis on ühendatud bakteri DNA-ga, teised - kromosomaalse DNA fragmente, mis on omavahel ühendatud, ja kolmandad - redutseeritud tsirkulaarset plasmiidi või selle dimeeri (joonis 1). . 4).
Seejärel viiakse see segu läbi geneetiline transformatsioon bakterid, mis ei sisalda plasmiide. Muutumine- organismi raku poolt keskkonnast vaba DNA molekuli imendumise ja genoomi sisseviimise protsess, mille tulemusena ilmnevad sellises rakus DNA doonororganismile iseloomulikud uued pärilikud tunnused. Igasse rakku saab siseneda ja paljuneda ainult üks plasmiid. Sellised rakud asetatakse tahkele toitekeskkonnale, mis sisaldab antibiootikumi tetratsükliini. Rakud, kes plasmiidi ei saanud, sellel söötmel ei kasva ning plasmiidi kandvad rakud moodustavad kolooniaid, millest igaüks sisaldab vaid ühe raku järglasi, s.o. kõik koloonia rakud kannavad sama plasmiidi (vt joonis 5).
Järgmiseks on ülesandeks valida ainult need rakud, millesse insertsiooniga vektor langes, ja eristada neid rakkudest, mis kannavad ainult vektorit ilma insertsioonita või ei kanna vektorit üldse. Seda soovitud lahtrite valimise protsessi nimetatakse aretus... Selleks kasutage selektiivsed markerid- tavaliselt antibiootikumiresistentsuse geenid vektoris ja selektiivne meedia mis sisaldavad antibiootikume või muid selektsiooni tagavaid aineid.
Meie näites subkultuuritakse ampitsilliini juuresolekul kasvatatud kolooniate rakud kahte söötmesse: esimene sisaldab ampitsilliini ja teine tetratsükliini. Ainult plasmiidi sisaldavad kolooniad kasvavad mõlemal söötmel, samas kui kolooniad, mis sisaldavad plasmiididesse sisestatud kromosomaalset DNA-d, ei kasva tetratsükliiniga söötmel (joonis 5). Nende hulgast valitakse spetsiaalsete meetoditega välja need, mis sisaldavad meile huvipakkuvat geeni, kasvatatakse piisavas koguses ja eraldatakse plasmiidne DNA. Sellest lõigatakse välja huvipakkuv individuaalne geen, kasutades samu restriktsiooniensüüme, mida kasutati rekombinantse DNA saamiseks. Selle geeni DNA-d saab kasutada nukleotiidide järjestuse määramiseks, selle sisestamiseks organismi uute omaduste saamiseks või soovitud valgu sünteesimiseks. Seda geenide eraldamise meetodit nimetatakse molekulaarne kloonimine.
Eukarüootsete organismide uuringutes on väga mugav kasutada fluorestseeruvaid valke markergeenidena. Esimese fluorestseeruva valgu geen, roheline fluorestseeruv valk (GFP) eraldati meduusist Aqeuorea victoria ja viidi erinevatesse mudelorganismidesse (vt joonis 6) 2008. aastal said O. Shimomura, M. Chalfi ja R. Tsien selle valgu avastamise ja kasutamise eest Nobeli preemia.
Seejärel eraldati teiste fluorestseeruvate valkude geenid - punane, sinine, kollane. Neid geene on kunstlikult modifitseeritud, et toota soovitud omadustega valke. Fluorestseeruvate valkude mitmekesisus on näidatud joonisel fig. 7, mis näitab Petri tassi bakteritega, mis sisaldavad erinevate fluorestseeruvate valkude geene.
fluorestseeruvate valkude rakendamine
Fluorestseeruva valgu geeni saab ligeerida mis tahes muu valgu geeniga, siis tekib translatsiooni käigus üks valk – translatsiooniliselt liitvalk või sulandumine(liitvalk), mis fluorestseerib. Seega on võimalik uurida näiteks mis tahes huvipakkuvate valkude paiknemist (asukohta) rakus, nende liikumist. Ekspresseerides fluorestseeruvaid valke ainult teatud tüüpi rakkudes, on võimalik seda tüüpi rakke markeerida paljurakulises organismis (vt joonis 8 - hiire aju, mille üksikutel neuronitel on fluorestseeruvate geenide teatud kombinatsiooni tõttu erinev värvus valgud). Fluorestseeruvad valgud on kaasaegses molekulaarbioloogias asendamatud vahendid.
Teist meetodit geenide saamiseks nimetatakse polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)... See põhineb DNA polümeraaside võimel täiendada DNA teist ahelat mööda komplementaarset ahelat, nagu see juhtub rakkudes DNA replikatsiooni ajal.
Selle meetodi replikatsiooni alguspunkti määrab kaks väikest DNA tükki, mida nimetatakse seemned, või praimerid... Need praimerid on komplementaarsed kahe DNA ahela huvipakkuva geeni otstega. Esiteks segatakse kromosomaalne DNA, millest geen tuleb eraldada, seemnetega ja kuumutatakse temperatuurini 99 ° C. See toob kaasa vesiniksidemete purunemise ja DNA ahelate lahknemise. Seejärel alandatakse temperatuuri 50–70 °C-ni (olenevalt seemnete pikkusest ja järjestusest). Nendes tingimustes kinnituvad praimerid kromosomaalse DNA komplementaarsete piirkondade külge, moodustades korrapärase topeltheeliksi (vt joonis 9). Pärast seda lisatakse kõigi nelja DNA sünteesiks vajaliku nukleotiidi ja DNA polümeraasi segu. Ensüüm pikendab praimereid, ehitades kaheahelalise DNA, kust praimerid kinnituvad, s.t. geeni otstest kuni üheahelalise kromosoomimolekuli lõpuni. 
Kui segu nüüd uuesti kuumutada, hajuvad kromosomaalsed ja äsja sünteesitud ahelad. Pärast jahutamist ühendavad need uuesti seemned, mida võetakse suures koguses (vt joonis 10).
Äsja sünteesitud ahelatel kinnituvad nad mitte selle otsa külge, millest esimene süntees algas, vaid selle vastasotsa, kuna DNA ahelad on paralleelsed. Seetõttu valmib sellistel ahelatel teises sünteesitsüklis ainult geenile vastav järjestus (vt joonis 11).
See meetod kasutab termofiilsete bakterite DNA polümeraasi, mis talub keemist ja töötab temperatuuril 70–80 ° C, seda pole vaja iga kord lisada, kuid piisab, kui lisada see katse alguses. Korrates kuumutamis- ja jahutusprotseduure samas järjestuses, saame igas tsüklis kahekordistada nende jadade arvu, mis on mõlemast otsast piiratud süstitud seemnetega (vt joonis 12).
Umbes 25 sellise tsükli järel suureneb geeni koopiate arv enam kui miljon korda. Selliseid koguseid saab katseklaasi sisestatud kromosomaalsest DNA-st kergesti eraldada ja kasutada erinevatel eesmärkidel.
Teine oluline saavutus on DNA nukleotiidide järjestuse määramise meetodite väljatöötamine - DNA sekveneerimine(ingliskeelsest järjestusest - järjestus). Selleks on vaja saada mõne kirjeldatud meetodi abil muust DNA-st puhtad geenid. Seejärel eraldatakse DNA ahelad kuumutamise teel ja neile lisatakse radioaktiivse fosfori või fluorestseeruva märgisega märgistatud praimer. Pange tähele, et võetakse üks seeme, mis täiendab ühte haru. Seejärel lisatakse DNA polümeraas ja 4 nukleotiidi segu. Selline segu jagatakse 4 osaks ja igaühele lisatakse üks nukleotiididest, modifitseeritud nii, et see ei sisaldaks hüdroksüülrühma desoksüriboosi kolmanda aatomi juures. Kui selline nukleotiid sisaldub sünteesitud DNA ahelas, siis selle pikenemine ei saa jätkuda, sest polümeraasil pole enam kuhugi järgmist nukleotiidi kinnitada. Seetõttu DNA süntees lõpetatakse pärast sellise nukleotiidi kaasamist. Selliseid nukleotiide, mida nimetatakse dideoksünukleotiidideks, lisatakse palju vähem kui tavalisi, mistõttu ahela lõpetamine toimub ainult aeg-ajalt ja igas ahelas erinevates kohtades. Tulemuseks on erineva pikkusega ahelate segu, mille mõlema lõpus on sama nukleotiid. Seega vastab ahela pikkus uuritava järjestuse nukleotiidide arvule, näiteks kui meil oli adenüüldideoksünukleotiid ja saadud ahelad olid 2, 7 ja 12 nukleotiidi pikkused, siis teises geenis oli adeniin, seitsmes ja kaheteistkümnes positsioon. Saadud ahelate segu saab elektroforeesi abil hõlpsasti suuruse järgi eraldada ja sünteesitud ahelaid saab identifitseerida radioaktiivsuse järgi röntgenfilmil (vt joonis 10).
Selgub joonise allosas näidatud pilt, mida nimetatakse raadio autogrammiks. Liikudes mööda seda alt üles ja lugedes iga tsooni veergude kohal olevat tähte, saame nukleotiidjärjestuse, mis on näidatud autogrammist paremal oleval joonisel. Selgus, et sünteesi ei peata mitte ainult dideoksünukleotiidid, vaid ka nukleotiidid, milles suhkru kolmandale positsioonile on kinnitunud mingi keemiline rühm, näiteks fluorestseeruv värvaine. Kui iga nukleotiid on tähistatud oma värviga, siis sünteesitud ahelate eraldamisel saadud tsoonid helendavad erineva valgusega. See võimaldab reaktsiooni ühes katseklaasis üheaegselt läbi viia kõigi nukleotiidide jaoks ja saadud ahelaid pikkusega jagades nukleotiide värvi järgi tuvastada (vt joonis 11).
Sellised meetodid võimaldasid määrata mitte ainult üksikute geenide järjestusi, vaid lugeda ka terveid genoome. Nüüd on välja töötatud veelgi kiiremad meetodid geenide nukleotiidide järjestuste määramiseks. Kui inimese paarisgenoomi dešifreeris suur rahvusvaheline konsortsium esimesel viidatud meetodil 12 aastaga, teise, teist kasutades kolme aastaga, siis nüüd saab seda teha kuu ajaga. See võimaldab ennustada inimese eelsoodumust paljudele haigustele ja võtta ette meetmed nende vältimiseks.
