Molekulaarbioloogia, teadus, mis seab oma ülesandeks teadmise elunähtuste olemusest, uurides bioloogilisi objekte ja süsteeme molekulaarsele tasemele läheneval, mõnel juhul isegi selle piirini jõudval tasemel. Lõppeesmärgiks on välja selgitada, kuidas ja mil määral ilmnevad elule iseloomulikud ilmingud, nagu pärilikkus, omasuguste taastootmine, valkude biosüntees, erutuvus, kasv ja areng, info talletamine ja edastamine, energia muundamine, liikuvus jne. , on tingitud bioloogiliselt oluliste ainete molekulide struktuurist, omadustest ja vastastikmõjust, eelkõige kahest põhiklassist suure molekulmassiga biopolümeerid – valgud ja nukleiinhapped. Eripäraks M. b. - elututel objektidel või elu kõige primitiivsematele ilmingutele omane elunähtuste uurimine. Need on bioloogilised moodustised rakutasandilt ja allapoole: subtsellulaarsed organellid, nagu isoleeritud rakutuumad, mitokondrid, ribosoomid, kromosoomid, rakumembraanid; edasi - süsteemid, mis seisavad elusa ja eluta looduse piiril - viirused, sh bakteriofaagid ja lõpetades elusaine olulisemate komponentide molekulidega - nukleiinhapped ja valgud.
Vundamendi, millele M. b. arenes, panid sellised teadused nagu geneetika, biokeemia, elementaarprotsesside füsioloogia jne. M. b. arenemise päritolu järgi. lahutamatult seotud molekulaargeneetikaga, mis on jätkuvalt oluline osa
Eripäraks M. b. on selle kolmemõõtmelisus. M. olemus. M. Perutz näeb seda bioloogiliste funktsioonide tõlgendamisel molekulaarstruktuuri kaudu. M. b. seab oma ülesandeks saada vastused küsimusele "kuidas", olles õppinud kogu molekuli struktuuri rolli ja osaluse olemust, ning küsimustele "miks" ja "miks", olles ühelt poolt selgitanud, molekuli (taas eeskätt valkude ja nukleiinhapete) omaduste ja tema poolt täidetavate funktsioonide vaheline seos ning teisalt selliste üksikute funktsioonide roll elutegevuse ilmingute üldises kompleksis.
Suured edusammud molekulaarbioloogias. Siin on nende saavutuste kaugeltki täielik loetelu: DNA, igat tüüpi RNA ja ribosoomide struktuuri ja bioloogilise funktsiooni mehhanismi avalikustamine, geneetilise koodi avalikustamine; pöördtranskriptsiooni, st DNA sünteesi avastamine RNA matriitsil; hingamisteede pigmentide talitlusmehhanismide uurimine; kolmemõõtmelise struktuuri ja selle funktsionaalse rolli avastamine ensüümide toimel, maatrikssünteesi põhimõte ja valkude biosünteesi mehhanismid; viiruste struktuuri ja nende replikatsioonimehhanismide, antikehade primaarse ja osaliselt ruumilise struktuuri avalikustamine; üksikute geenide eraldamine, geeni, sealhulgas inimese, keemiline ja seejärel bioloogiline (ensümaatiline) süntees väljaspool rakku (in vitro); geenide ülekandmine ühest organismist teise, sealhulgas inimrakkudesse; järjest suureneva hulga üksikute valkude, peamiselt ensüümide, aga ka nukleiinhapete keemilise struktuuri kiiresti arenev dešifreerimine; mõnede kasvava keerukusega bioloogiliste objektide "isekoosnemise" nähtuste tuvastamine, alustades nukleiinhappemolekulidest kuni mitmekomponentsete ensüümide, viiruste, ribosoomideni jne; allosteeriliste ja muude bioloogiliste funktsioonide ja protsesside reguleerimise aluspõhimõtete selgitamine.
Molekulaarbioloogia probleemid. Koos märgitud oluliste ülesannetega M. b. ("äratundmise", enese kokkupanemise ja integreerimise mustrite tunnetamine) lähituleviku teaduslike otsingute pakiline suund on selliste meetodite väljatöötamine, mis võimaldavad dešifreerida struktuuri ja seejärel kolmemõõtmelist ruumilist korraldust. suure molekulmassiga nukleiinhapped. Kõik olulisemad meetodid, mille kasutamine tagas arstiteaduse tekke ja edu, pakkusid välja ja töötasid välja füüsikud (ultratsentrifuugimine, röntgenstruktuurianalüüs, elektronmikroskoopia, tuumamagnetresonants jne). Peaaegu kõik uued füüsikalised eksperimentaalsed lähenemised (näiteks arvutite, sünkrotroni- või bremsstrahlung-kiirguse kasutamine, lasertehnoloogia jt) avavad uusi võimalusi arstiteaduse probleemide süvauurimiseks. Kõige olulisemate praktilist laadi probleemide hulgas, millele vastust oodatakse M. b.-lt, on esiteks pahaloomulise kasvu molekulaarse aluse probleem, seejärel - pärilike haiguste ennetamise ja võib-olla ka nendest ülesaamise viisid - "molekulaarsed haigused". Bioloogilise katalüüsi molekulaarse aluse, st ensüümide toime selgitamine on väga oluline. Tähtsamate kaasaegsete suundade hulgas M. b. peaks sisaldama soovi dešifreerida hormoonide, toksiliste ja meditsiiniliste ainete molekulaarseid toimemehhanisme, samuti selgitada selliste rakustruktuuride nagu bioloogiliste membraanide molekulaarstruktuuri ja toimimise üksikasju, mis osalevad läbitungimise ja transpordi protsesside reguleerimises. ainetest. Kaugemad väravad M. b. - närviprotsesside olemuse, mälumehhanismide jms tunnetamine. Üks olulisi esilekerkivaid sektsioone M. b. - nn. geenitehnoloogia, mis seab oma ülesandeks elusorganismide geneetilise aparaadi (genoomi) sihipärase toimimise, alustades mikroobidest ja madalamatest (ükuraksetest) ning lõpetades inimesega (viimasel juhul eelkõige radikaalse ravi eesmärgil). pärilike haiguste ravi ja geneetiliste defektide korrigeerimine).
MB olulisemad valdkonnad:
- Molekulaargeneetika - raku geneetilise aparaadi struktuurse ja funktsionaalse korralduse ning päriliku teabe rakendamise mehhanismi uurimine.
- Molekulaarviroloogia – viiruste ja rakkude vastasmõju molekulaarsete mehhanismide uurimine
– Molekulaarimmunoloogia – uurib organismi immuunreaktsioonide mustreid
- molekulaararengu bioloogia - uurib rakkude erineva kvaliteediga välimust organismide individuaalse arengu ja rakkude spetsialiseerumise käigus.
Peamised uurimisobjektid: Viirused (sh bakteriofaagid), Rakud ja subtsellulaarsed struktuurid, Makromolekulid, Mitmerakulised organismid.
Tüüp
Palk
Molekulaarbioloogid uurivad molekulaarprotsesse kui kõigi eluprotsesside alust. Saadud tulemuste põhjal töötavad nad välja kontseptsioonid biokeemiliste protsesside kasutamiseks näiteks meditsiiniuuringutes ja diagnostikas või biotehnoloogias. Lisaks võivad nad olla seotud farmaatsiatoodete valmistamise, tootearenduse, kvaliteedi tagamise või raviminõustamisega.
Molekulaarbioloogid võivad töötada erinevates valdkondades. Näiteks on need seotud uurimistulemuste kasutamisega tootmiseks sellistes valdkondades nagu geenitehnoloogia, valgukeemia või farmakoloogia (ravimite avastamine). Keemia- ja farmaatsiatööstuses hõlbustavad need äsja väljatöötatud toodete juurutamist teadusuuringutest tootmisse, tooteturundusse ja kasutajate nõustamisse.
Teaduslikes uuringutes uurivad molekulaarbioloogid orgaaniliste ühendite keemilisi ja füüsikalisi omadusi, samuti keemilisi protsesse (rakkude ainevahetuse vallas) elusorganismides ning avaldavad uuringute tulemused. Kõrgkoolides õpetavad nad tudengeid, valmistuvad loenguteks ja seminarideks, kontrollivad kirjalikke töid ja sooritavad eksameid. Iseseisev teaduslik tegevus on võimalik alles pärast magistrikraadi ja doktorikraadi omandamist.
Molekulaarbioloogid leiavad töökohti nagu
Saksamaal molekulaarbioloogide palk on
(erinevate Saksamaa statistikaametite ja tööhõiveteenistuste andmetel)
Molekulaarbioloogid uurivad molekulaarprotsesse kui kõigi eluprotsesside alust. Saadud tulemuste põhjal töötavad nad välja kontseptsioonid biokeemiliste protsesside kasutamiseks näiteks meditsiiniuuringutes ja diagnostikas või biotehnoloogias. Lisaks võivad nad olla seotud farmaatsiatoodete valmistamise, tootearenduse, kvaliteedi tagamise või raviminõustamisega.
Molekulaarbioloogia ehk molekulaargeneetika tegeleb nukleiinhapete struktuuri ja biosünteesi uurimisega ning selle informatsiooni edastamise ja rakendamisega valkude kujul seotud protsessidega. See võimaldab mõista nende funktsioonide valusaid häireid ja võimalusel neid geeniteraapiaga ravida. Biotehnoloogia ja geenitehnoloogia jaoks on olemas liidesed, mille käigus luuakse lihtsaid organisme, nagu bakterid ja pärm, et muuta farmakoloogilist või kaubanduslikku huvi pakkuvad ained sihitud mutatsioonide kaudu kaubanduslikult kättesaadavaks.
Farmaatsia- ja keemiatööstus pakub molekulaarbioloogidele mitmeid töövaldkondi. Tööstuslikus keskkonnas analüüsivad nad biotransformatsiooniprotsesse või arendavad ja täiustavad protsesse toimeainete ja farmatseutiliste vahesaaduste mikrobioloogiliseks tootmiseks. Lisaks tegelevad nad äsja arendatud toodete üleminekuga uurimistööst tootmisse. Kontrollimisülesannete kaudu tagavad nad, et tootmisrajatised, seadmed, analüüsimeetodid ja kõik tundlike toodete (nt ravimid) tootmise etapid vastavad alati nõutavatele kvaliteedistandarditele. Lisaks nõustavad molekulaarbioloogid kasutajaid uute toodete kasutamisel.
Juhtivate ametikohtade jaoks on sageli vaja magistriprogrammi.
Teaduse ja uurimistöö valdkonnas tegelevad molekulaarbioloogid selliste teemadega nagu valkude äratundmine, transport, voltimine ja kodifitseerimine rakus. Uurimistulemused, mis on aluseks praktilisele rakendamisele erinevates valdkondades, avaldatakse ja tehakse seeläbi kättesaadavaks teistele teadlastele ja üliõpilastele. Konverentsidel ja kongressidel arutatakse ja tutvustatakse teadustegevuse tulemusi. Molekulaarbioloogid peavad loenguid ja seminare, suunavad teadustööd ja sooritavad eksameid.
Iseseisev teadustegevus eeldab magistri- ja doktorikraadi.
Molekulaarbioloogia on kogenud oma uurimismeetodite kiire arengu perioodi, mis eristab seda nüüd biokeemiast. Nende hulka kuuluvad eelkõige geenitehnoloogia, kloonimise, kunstliku ekspressiooni ja geenide väljalülitamise meetodid. Kuna DNA on geneetilise informatsiooni materiaalne kandja, siis on molekulaarbioloogia muutunud geneetikale palju lähedasemaks ning ristmikul tekkis molekulaargeneetika, mis on nii geneetika kui ka molekulaarbioloogia haru. Nii nagu molekulaarbioloogias kasutatakse laialdaselt viirusi uurimisvahendina, kasutatakse viroloogias nende probleemide lahendamiseks molekulaarbioloogia meetodeid. Geneetilise informatsiooni analüüsiks on kaasatud arvutitehnoloogia, millega seoses on tekkinud uued molekulaargeneetika suunad, mida mõnikord peetakse ka eridistsipliinideks: bioinformaatika, genoomika ja proteoomika.
Selle fundamentaalse avastuse valmistas ette pikk viiruste ja bakterite geneetika ja biokeemia uurimise etapp.
1928. aastal näitas Frederick Griffith esimest korda, et kuumusega tapetud patogeensete bakterite ekstrakt võib edastada patogeensuse mitteohtlikele bakteritele. Bakterite transformatsiooni uurimine viis hiljem patogeense aine puhastamiseni, mis vastupidiselt ootustele osutus mitte valguks, vaid nukleiinhappeks. Iseenesest ei ole nukleiinhape ohtlik, ta kannab edasi ainult geene, mis määravad mikroorganismi patogeensuse ja muud omadused.
XX sajandi 50ndatel näidati, et bakteritel on primitiivne seksuaalprotsess, nad on võimelised vahetama kromosomaalset DNA-d, plasmiide. Plasmiidide avastamine, nagu transformatsioon, oli molekulaarbioloogias laialt levinud plasmiiditehnoloogia aluseks. Teine oluline metoodika avastus oli bakteriaalsete viiruste ja bakteriofaagide avastamine 20. sajandi alguses. Faagid võivad kanda ka geneetilist materjali ühest bakterirakust teise. Bakterite nakatumine faagidega põhjustab bakteri RNA koostise muutumise. Kui ilma faagideta on RNA koostis sarnane bakteriaalse DNA koostisega, siis pärast nakatumist muutub RNA sarnasemaks bakteriofaagi DNA-ga. Seega leiti, et RNA struktuuri määrab DNA struktuur. Valkude sünteesi kiirus rakkudes omakorda sõltub RNA-valgu komplekside hulgast. Nii see sõnastati Molekulaarbioloogia keskne dogma: DNA ↔ RNA → valk.
Molekulaarbioloogia edasise arenguga kaasnes nii selle metoodika väljatöötamine, eelkõige DNA nukleotiidjärjestuse määramise meetodi leiutamine (W. Gilbert ja F. Senger, Nobeli keemiaauhind, 1980), kui ka uued. avastused geenide ehituse ja funktsioneerimise uuringute vallas (vt. Geneetika ajalugu). 21. sajandi alguseks saadi andmeid kogu inimese DNA algstruktuuri ja mitmete teiste meditsiini, põllumajanduse ja teadusuuringute jaoks kõige olulisemate organismide kohta, mis tõi kaasa mitme uue bioloogia suuna: genoomika tekkimise. , bioinformaatika jne.
Wikimedia sihtasutus. 2010. aasta.
MOLEKULAARBIOLOOGIA- õpib DOS-i. elu omadused ja ilmingud molekulaarsel tasandil. Olulisemad suunad M. b. on uuringud rakkude geneetilise aparaadi struktuurse ja funktsionaalse korralduse ning päriliku teabe realiseerimise mehhanismi kohta ... ... Bioloogia entsüklopeediline sõnastik
MOLEKULAARBIOLOOGIA- uurib elu põhiomadusi ja ilminguid molekulaarsel tasandil. Saab teada, kuidas ja mil määral on organismide kasv ja areng, päriliku informatsiooni talletamine ja edasiandmine, energia muundumine elusrakkudes jne nähtused tingitud ... Suur entsüklopeediline sõnaraamat
MOLEKULAARBIOLOOGIA Kaasaegne entsüklopeedia
MOLEKULAARBIOLOOGIA- MOLEKULAARBIOLOOGIA, elusorganisme moodustavate Molekulide ehituse ja toimimise bioloogiline uurimine. Peamised uurimisvaldkonnad on valkude ja NUKLEEHAPETE, näiteks DNA, füüsikalised ja keemilised omadused. Vaata ka… … Teaduslik ja tehniline entsüklopeediline sõnastik
molekulaarbioloogia- osa biol., mis uurib elu põhiomadusi ja ilminguid molekulaarsel tasandil. Saab teada, kuidas ja mil määral toimub organismide kasv ja areng, päriliku informatsiooni talletamine ja edastamine, energia muundumine elusrakkudes ja ... ... Mikrobioloogia sõnaraamat
molekulaarbioloogia- - Biotehnoloogia teemad EN molekulaarbioloogia ... Tehniline tõlkija juhend
Molekulaarbioloogia- MOLEKULAARBIOLOOGIA, uurib elu põhiomadusi ja ilminguid molekulaarsel tasandil. Saab teada, kuidas ja mil määral toimub organismide kasv ja areng, päriliku informatsiooni talletamine ja edastamine, energia muundumine elusrakkudes ja ... ... Illustreeritud entsüklopeediline sõnaraamat
Molekulaarbioloogia- teadus, mis seab oma ülesandeks elutegevuse nähtuste olemuse tundmise, uurides bioloogilisi objekte ja süsteeme molekulaarsele tasemele läheneval, mõnel juhul isegi selle piirini jõudval tasemel. Lõppeesmärk selles ...... Suur Nõukogude entsüklopeedia
MOLEKULAARBIOLOOGIA- uurib elunähtusi makromolekulide tasemel (hl. obr. valgud ja nukleiinhape) rakulistes struktuurides (ribosoomid jne), viirustes, aga ka rakkudes. M. värav. nende makromolekulide rolli ja toimimismehhanismi kindlaksmääramine, mis põhineb ... ... Keemia entsüklopeedia
molekulaarbioloogia- uurib elu põhiomadusi ja ilminguid molekulaarsel tasandil. Saab teada, kuidas ja mil määral toimub organismide kasv ja areng, päriliku teabe talletamine ja edastamine, energia muundumine elusrakkudes ja muud nähtused ... ... entsüklopeediline sõnaraamat
Nukleiinhapete ja valkude biosünteesi uurimise edusammud on viinud mitmete meetodite loomiseni, millel on suur rakenduslik tähtsus meditsiinis, põllumajanduses ja paljudes teistes tööstusharudes.
Pärast geneetilise koodi ning päriliku teabe säilitamise ja realiseerimise põhiprintsiipide uurimist jõudis molekulaarbioloogia areng ummikusse, kuna puudusid meetodid, mis saaksid geenidega manipuleerida, neid isoleerida ja muuta. Nende meetodite esilekerkimine toimus 1970. ja 1980. aastatel. See andis võimsa tõuke selle tänaseni õitseva teadusvaldkonna arengule. Esiteks puudutavad need meetodid üksikute geenide tootmist ja nende viimist teiste organismide rakkudesse (molekulaarne kloonimine ja transgenees, PCR), samuti geenides nukleotiidide järjestuse määramise meetodeid (DNA ja RNA järjestuse määramine). Neid meetodeid käsitletakse üksikasjalikumalt allpool. Alustame lihtsaimast põhimeetodist, elektroforeesist, ja seejärel liigume edasi arenenumate meetodite juurde.
See on põhiline DNA tehnika, mida kasutatakse koos peaaegu kõigi teiste meetoditega soovitud molekulide eraldamiseks ja tulemuste analüüsimiseks. DNA fragmentide eraldamiseks pikkuse järgi kasutatakse geelelektroforeesi meetodit. DNA on hape, selle molekulid sisaldavad fosforhappe jääke, mis lõhustavad prootoni ja omandavad negatiivse laengu (joonis 1).
Seetõttu liiguvad elektriväljas DNA molekulid anoodile – positiivselt laetud elektroodile. See toimub elektrolüüdi lahuses, mis sisaldab laengukandjate ioone, nii et see lahus juhib voolu. Fragmentide eraldamiseks kasutatakse tihedat polümeergeeli (agaroos või polüakrüülamiid). Mida rohkem DNA molekule sellesse "põimuvad", seda pikemad nad on ja seetõttu liiguvad pikimad molekulid kõige aeglasemalt ja lühemad - kõige kiiremini (joonis 2). Enne või pärast elektroforeesi töödeldakse geeli värvainetega, mis seonduvad DNA-ga ja fluorestseeruvad ultraviolettvalguses, ning saadakse geelis olevate ribade muster (vt joonis 3). Proovi DNA fragmentide pikkuste määramiseks võrreldakse neid markeriga – standardpikkusega fragmentide komplektiga, mida kantakse paralleelselt samale geelile (joonis 4).
DNA-ga töötamise kõige olulisemad vahendid on ensüümid, mis transformeerivad DNA-d elusrakkudes: DNA polümeraasid, DNA ligaasid ja restriktsiooniendonukleaasid ehk restriktsiooniensüümid. DNA polümeraas viia läbi DNA maatrikssünteesi, mis võimaldab DNA-d katseklaasis paljundada. DNA ligaasidõmble kokku DNA molekule või parandab neis olevaid lünki. Restriktsiooni endonukleaasid, või restriktsiooniensüümid, lõigake DNA molekulid rangelt määratletud järjestuste järgi, mis võimaldab teil DNA kogumassist üksikuid fragmente välja lõigata. Need fragmendid võivad mõnel juhul sisaldada eraldi geene.
Restriktsiooniendonukleaaside poolt äratuntavad järjestused on sümmeetrilised ja katkestused võivad tekkida sellise järjestuse keskel või nihkega (mõlemas DNA ahelas samas kohas). Erinevat tüüpi restriktsiooniensüümide toimeskeem on näidatud joonisel fig. 1. Esimesel juhul saadakse nn "nürid" otsad ja teisel "kleepuvad" otsad. Põhja "kleepuvate" otste korral osutub kett teisest lühemaks, moodustatakse üheahelaline osa, mille mõlemas otsas on identne sümmeetriline järjestus.
Terminaalsed järjestused on samad, kui mis tahes DNA lõigatakse antud restriktsiooniensüümiga ja neid saab uuesti siduda, kuna neil on komplementaarsed järjestused. Neid saab DNA ligaasi kasutades kokku õmmelda ja saada üks molekul. Seega on võimalik kombineerida kahe erineva DNA fragmente ja saada nn rekombinantne DNA... Seda lähenemist kasutatakse molekulaarse kloonimise meetodis, mis võimaldab hankida üksikuid geene ja viia need rakkudesse, mis võivad moodustada geenis kodeeritud valku.
Molekulaarses kloonimises kasutatakse kahte DNA molekuli – huvipakkuvat geeni sisaldavat inserti ja vektor- DNA, mis toimib kandjana. Insert "õmmeldakse" vektorisse, kasutades ensüüme, et saada uus rekombinantne DNA molekul, seejärel viiakse see molekul peremeesrakkudesse ja need rakud moodustavad toitainekeskkonnas kolooniaid. Koloonia on ühe raku järglane, see tähendab kloon, kõik koloonia rakud on geneetiliselt identsed ja sisaldavad sama rekombinantset DNA-d. Sellest ka mõiste "molekulaarne kloonimine", st meile huvipakkuvat DNA fragmenti sisaldava rakkude klooni saamine. Pärast meile huvipakkuvat inserti sisaldavate kolooniate saamist on võimalik seda inserti iseloomustada erinevate meetoditega, näiteks määrata selle täpne järjestus. Rakud võivad toota ka insertiga kodeeritud valku, kui see sisaldab funktsionaalset geeni.
Kui rakkudesse sisestatakse rekombinantne molekul, toimub nende rakkude geneetiline transformatsioon. Muutumine- organismi raku poolt keskkonnast vaba DNA molekuli imendumise ja genoomi sisseviimise protsess, mille tulemusena ilmnevad sellises rakus DNA doonororganismile iseloomulikud uued pärilikud tunnused. Näiteks kui sisestatud molekul sisaldab antibiootikumi ampitsilliini suhtes resistentsuse geeni, siis transformeeritud bakterid kasvavad selle juuresolekul. Enne transformatsiooni põhjustas ampitsilliin nende surma, see tähendab, et transformeeritud rakkudes ilmneb uus tunnus.
Vektoril peab olema mitmeid omadusi:
Esiteks on see suhteliselt väike DNA molekul, mida on lihtne manipuleerida.
Teiseks, selleks, et DNA rakus säiliks ja paljuneks, peab see sisaldama kindlat järjestust, mis tagab selle replikatsiooni (replikatsiooni alguspunkt ehk replikatsiooni alguspunkt).
Kolmandaks peab see sisaldama geenimarker, mis tagab ainult nende rakkude valiku, millesse vektor on langenud. Tavaliselt on need antibiootikumiresistentsuse geenid – siis surevad antibiootikumi juuresolekul kõik rakud, mis vektorit ei sisalda.
Geenide kloonimine toimub kõige sagedamini bakterirakkudes, kuna neid on lihtne kasvatada ja paljuneda kiiresti. Bakterirakk sisaldab tavaliselt ühte suurt ringikujulist, mitme miljoni nukleotiidipaari pikkust DNA molekuli, mis sisaldab kõiki bakteritele vajalikke geene – bakterikromosoomi. Lisaks sellele on mõnes bakteris väike (mitu tuhat aluspaari) ringikujuline DNA nn plasmiidid(joon. 2). Need, nagu põhiline DNA, sisaldavad nukleotiidide järjestust, mis tagavad DNA replikatsioonivõime (ori). Plasmiidid replitseerivad peamisest (kromosomaalsest) DNA-st sõltumatult, seetõttu esinevad nad rakus suure hulga koopiatena. Paljud neist plasmiididest kannavad antibiootikumiresistentsuse geene, et eristada plasmiidi kandvaid rakke normaalsetest rakkudest. Enamasti kasutatakse plasmiide, mis kannavad kahte geeni, mis tagavad resistentsuse kahe antibiootikumi, näiteks tetratsükliini ja amitsilliini suhtes. Selliste plasmiidsete DNA-de eraldamiseks, mis on vabad bakteri põhikromosoomi DNA-st, on olemas lihtsad meetodid.
Geenide ülekandumist ühest organismist teise nimetatakse transgenees ja sellised muundatud organismid - transgeensed... Geenide ülekandmisel mikroorganismide rakkudesse saadakse meditsiiniliste vajaduste jaoks rekombinantsed valgupreparaadid, eelkõige inimese valgud, mis ei põhjusta immuunsüsteemi äratõukereaktsiooni - interferoonid, insuliin ja muud proteiinhormoonid, raku kasvufaktorid, aga ka valgu jaoks mõeldud valgud. vaktsiinide tootmine. Keerulisematel juhtudel, kui valkude modifitseerimine kulgeb õigesti ainult eukarüootsetes rakkudes, kasutatakse transgeenseid rakukultuure või transgeenseid loomi, eelkõige kariloomi (peamiselt kitsesid), kes eritavad vajalikke valke piima või eraldatakse valke nende verest. . Nii saadakse antikehad, hüübimisfaktorid ja muud valgud. Transgeneesi meetodil saadakse põllukultuurid, mis on resistentsed herbitsiidide ja kahjurite suhtes ning millel on muid kasulikke omadusi. Transgeensete mikroorganismide abil puhastavad nad reovett ja võitlevad reostusega, leidub isegi transgeenseid mikroobe, mis suudavad õli lagundada. Lisaks on transgeensed tehnoloogiad teadusuuringutes asendamatud – bioloogia areng pole tänapäeval mõeldav ilma modifikatsiooni- ja geenisiirdemeetodite rutiinse kasutamiseta.
molekulaarse kloonimise tehnoloogia
Individuaalse geeni saamiseks mis tahes organismist eraldatakse sellest kogu kromosomaalne DNA ja lõigatakse see ühe või kahe restriktsiooniensüümiga. Ensüümid valitakse nii, et nad ei lõikaks meile huvipakkuvat geeni, vaid teeksid katkestusi piki selle servi ja teeksid 1 katkestuse plasmiidses DNA-s ühes resistentsusgeenis, näiteks ampitsilliini suhtes.
Molekulaarse kloonimise protsess hõlmab järgmisi samme:
Lõikamine ja õmblemine - ühe rekombinantse molekuli konstrueerimine inserdist ja vektorist.
Transformatsioon on rekombinantse molekuli viimine rakkudesse.
Valik – insertivektori saanud rakkude valimine.
Plasmiidset DNA-d töödeldakse samade restriktsiooniensüümidega ja see muundatakse lineaarseks molekuliks, kui valitakse selline restriktsiooniensüüm, mis lisab plasmiidi 1 tühimiku. Selle tulemusena on kõigi saadud DNA fragmentide otsad samad kleepuvad. Kui temperatuur on langetatud, ühendatakse need otsad juhuslikult ja ligeeritakse DNA ligaasiga (vt joonis 3).
Saadakse erineva koostisega ringikujuliste DNA-de segu: mõned neist sisaldavad spetsiifilist kromosomaalse DNA DNA järjestust, mis on ühendatud bakteri DNA-ga, teised - kromosomaalse DNA fragmente, mis on omavahel ühendatud, ja kolmandad - redutseeritud tsirkulaarset plasmiidi või selle dimeeri (joonis 1). . 4).
Seejärel viiakse see segu läbi geneetiline transformatsioon bakterid, mis ei sisalda plasmiide. Muutumine- organismi raku poolt keskkonnast vaba DNA molekuli imendumise ja genoomi sisseviimise protsess, mille tulemusena ilmnevad sellises rakus DNA doonororganismile iseloomulikud uued pärilikud tunnused. Igasse rakku saab siseneda ja paljuneda ainult üks plasmiid. Sellised rakud asetatakse tahkele toitekeskkonnale, mis sisaldab antibiootikumi tetratsükliini. Rakud, kes plasmiidi ei saanud, sellel söötmel ei kasva ning plasmiidi kandvad rakud moodustavad kolooniaid, millest igaüks sisaldab vaid ühe raku järglasi, s.o. kõik koloonia rakud kannavad sama plasmiidi (vt joonis 5).
Järgmiseks on ülesandeks valida ainult need rakud, millesse insertsiooniga vektor langes, ja eristada neid rakkudest, mis kannavad ainult vektorit ilma insertsioonita või ei kanna vektorit üldse. Seda soovitud lahtrite valimise protsessi nimetatakse aretus... Selleks kasutage selektiivsed markerid- tavaliselt antibiootikumiresistentsuse geenid vektoris ja selektiivne meedia mis sisaldavad antibiootikume või muid selektsiooni tagavaid aineid.
Meie näites subkultuuritakse ampitsilliini juuresolekul kasvatatud kolooniate rakud kahte söötmesse: esimene sisaldab ampitsilliini ja teine tetratsükliini. Ainult plasmiidi sisaldavad kolooniad kasvavad mõlemal söötmel, samas kui kolooniad, mis sisaldavad plasmiididesse sisestatud kromosomaalset DNA-d, ei kasva tetratsükliiniga söötmel (joonis 5). Nende hulgast valitakse spetsiaalsete meetoditega välja need, mis sisaldavad meile huvipakkuvat geeni, kasvatatakse piisavas koguses ja eraldatakse plasmiidne DNA. Sellest lõigatakse välja huvipakkuv individuaalne geen, kasutades samu restriktsiooniensüüme, mida kasutati rekombinantse DNA saamiseks. Selle geeni DNA-d saab kasutada nukleotiidide järjestuse määramiseks, selle sisestamiseks organismi uute omaduste saamiseks või soovitud valgu sünteesimiseks. Seda geenide eraldamise meetodit nimetatakse molekulaarne kloonimine.
Eukarüootsete organismide uuringutes on väga mugav kasutada fluorestseeruvaid valke markergeenidena. Esimese fluorestseeruva valgu geen, roheline fluorestseeruv valk (GFP) eraldati meduusist Aqeuorea victoria ja viidi erinevatesse mudelorganismidesse (vt joonis 6) 2008. aastal said O. Shimomura, M. Chalfi ja R. Tsien selle valgu avastamise ja kasutamise eest Nobeli preemia.
Seejärel eraldati teiste fluorestseeruvate valkude geenid - punane, sinine, kollane. Neid geene on kunstlikult modifitseeritud, et toota soovitud omadustega valke. Fluorestseeruvate valkude mitmekesisus on näidatud joonisel fig. 7, mis näitab Petri tassi bakteritega, mis sisaldavad erinevate fluorestseeruvate valkude geene.
fluorestseeruvate valkude rakendamine
Fluorestseeruva valgu geeni saab ligeerida mis tahes muu valgu geeniga, siis tekib translatsiooni käigus üks valk – translatsiooniliselt liitvalk või sulandumine(liitvalk), mis fluorestseerib. Seega on võimalik uurida näiteks mis tahes huvipakkuvate valkude paiknemist (asukohta) rakus, nende liikumist. Ekspresseerides fluorestseeruvaid valke ainult teatud tüüpi rakkudes, on võimalik seda tüüpi rakke markeerida paljurakulises organismis (vt joonis 8 - hiire aju, mille üksikutel neuronitel on fluorestseeruvate geenide teatud kombinatsiooni tõttu erinev värvus valgud). Fluorestseeruvad valgud on kaasaegses molekulaarbioloogias asendamatud vahendid.
Teist meetodit geenide saamiseks nimetatakse polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)... See põhineb DNA polümeraaside võimel täiendada DNA teist ahelat mööda komplementaarset ahelat, nagu see juhtub rakkudes DNA replikatsiooni ajal.
Selle meetodi replikatsiooni alguspunkti määrab kaks väikest DNA tükki, mida nimetatakse seemned, või praimerid... Need praimerid on komplementaarsed kahe DNA ahela huvipakkuva geeni otstega. Esiteks segatakse kromosomaalne DNA, millest geen tuleb eraldada, seemnetega ja kuumutatakse temperatuurini 99 ° C. See toob kaasa vesiniksidemete purunemise ja DNA ahelate lahknemise. Seejärel alandatakse temperatuuri 50–70 °C-ni (olenevalt seemnete pikkusest ja järjestusest). Nendes tingimustes kinnituvad praimerid kromosomaalse DNA komplementaarsete piirkondade külge, moodustades korrapärase topeltheeliksi (vt joonis 9). Pärast seda lisatakse kõigi nelja DNA sünteesiks vajaliku nukleotiidi ja DNA polümeraasi segu. Ensüüm pikendab praimereid, ehitades kaheahelalise DNA, kust praimerid kinnituvad, s.t. geeni otstest kuni üheahelalise kromosoomimolekuli lõpuni. 
Kui segu nüüd uuesti kuumutada, hajuvad kromosomaalsed ja äsja sünteesitud ahelad. Pärast jahutamist ühendavad need uuesti seemned, mida võetakse suures koguses (vt joonis 10).
Äsja sünteesitud ahelatel kinnituvad nad mitte selle otsa külge, millest esimene süntees algas, vaid selle vastasotsa, kuna DNA ahelad on paralleelsed. Seetõttu valmib sellistel ahelatel teises sünteesitsüklis ainult geenile vastav järjestus (vt joonis 11).
See meetod kasutab termofiilsete bakterite DNA polümeraasi, mis talub keemist ja töötab temperatuuril 70–80 ° C, seda pole vaja iga kord lisada, kuid piisab, kui lisada see katse alguses. Korrates kuumutamis- ja jahutusprotseduure samas järjestuses, saame igas tsüklis kahekordistada nende jadade arvu, mis on mõlemast otsast piiratud süstitud seemnetega (vt joonis 12).
Umbes 25 sellise tsükli järel suureneb geeni koopiate arv enam kui miljon korda. Selliseid koguseid saab katseklaasi sisestatud kromosomaalsest DNA-st kergesti eraldada ja kasutada erinevatel eesmärkidel.
Teine oluline saavutus on DNA nukleotiidide järjestuse määramise meetodite väljatöötamine - DNA sekveneerimine(ingliskeelsest järjestusest - järjestus). Selleks on vaja saada mõne kirjeldatud meetodi abil muust DNA-st puhtad geenid. Seejärel eraldatakse DNA ahelad kuumutamise teel ja neile lisatakse radioaktiivse fosfori või fluorestseeruva märgisega märgistatud praimer. Pange tähele, et võetakse üks seeme, mis täiendab ühte haru. Seejärel lisatakse DNA polümeraas ja 4 nukleotiidi segu. Selline segu jagatakse 4 osaks ja igaühele lisatakse üks nukleotiididest, modifitseeritud nii, et see ei sisaldaks hüdroksüülrühma desoksüriboosi kolmanda aatomi juures. Kui selline nukleotiid sisaldub sünteesitud DNA ahelas, siis selle pikenemine ei saa jätkuda, sest polümeraasil pole enam kuhugi järgmist nukleotiidi kinnitada. Seetõttu DNA süntees lõpetatakse pärast sellise nukleotiidi kaasamist. Selliseid nukleotiide, mida nimetatakse dideoksünukleotiidideks, lisatakse palju vähem kui tavalisi, mistõttu ahela lõpetamine toimub ainult aeg-ajalt ja igas ahelas erinevates kohtades. Tulemuseks on erineva pikkusega ahelate segu, mille mõlema lõpus on sama nukleotiid. Seega vastab ahela pikkus uuritava järjestuse nukleotiidide arvule, näiteks kui meil oli adenüüldideoksünukleotiid ja saadud ahelad olid 2, 7 ja 12 nukleotiidi pikkused, siis teises geenis oli adeniin, seitsmes ja kaheteistkümnes positsioon. Saadud ahelate segu saab elektroforeesi abil hõlpsasti suuruse järgi eraldada ja sünteesitud ahelaid saab identifitseerida radioaktiivsuse järgi röntgenfilmil (vt joonis 10).
Selgub joonise allosas näidatud pilt, mida nimetatakse raadio autogrammiks. Liikudes mööda seda alt üles ja lugedes iga tsooni veergude kohal olevat tähte, saame nukleotiidjärjestuse, mis on näidatud autogrammist paremal oleval joonisel. Selgus, et sünteesi ei peata mitte ainult dideoksünukleotiidid, vaid ka nukleotiidid, milles suhkru kolmandale positsioonile on kinnitunud mingi keemiline rühm, näiteks fluorestseeruv värvaine. Kui iga nukleotiid on tähistatud oma värviga, siis sünteesitud ahelate eraldamisel saadud tsoonid helendavad erineva valgusega. See võimaldab reaktsiooni ühes katseklaasis üheaegselt läbi viia kõigi nukleotiidide jaoks ja saadud ahelaid pikkusega jagades nukleotiide värvi järgi tuvastada (vt joonis 11).
Sellised meetodid võimaldasid määrata mitte ainult üksikute geenide järjestusi, vaid lugeda ka terveid genoome. Nüüd on välja töötatud veelgi kiiremad meetodid geenide nukleotiidide järjestuste määramiseks. Kui inimese paarisgenoomi dešifreeris suur rahvusvaheline konsortsium esimesel viidatud meetodil 12 aastaga, teise, teist kasutades kolme aastaga, siis nüüd saab seda teha kuu ajaga. See võimaldab ennustada inimese eelsoodumust paljudele haigustele ja võtta ette meetmed nende vältimiseks.
Biokeemia, biofüüsika, geneetika, tsütokeemia, paljude mikrobioloogia ja viroloogia harude areng XX sajandi 40. aastate alguses. tõi ta lähedale elunähtuste uurimisele molekulaarsel tasandil. Nende teaduste üheaegselt ja erinevatest külgedest saavutatud edu tõi kaasa tõsiasja, et keha peamised juhtimissüsteemid toimivad molekulaarsel tasandil ja nende teaduste edasine areng sõltub teaduse avalikustamisest. organismide keha moodustavate molekulide bioloogilised funktsioonid, nende osalemine sünteesis ja lagunemises, rakus olevate ühendite vastastikused muundumised ja paljunemine, samuti selle käigus toimuv energia- ja teabevahetus. Niisiis tekkis nende bioloogiliste distsipliinide ristmikul keemia ja füüsikaga täiesti uus haru - molekulaarbioloogia.
Erinevalt biokeemiast on kaasaegse molekulaarbioloogia tähelepanu suunatud peamiselt kõige olulisemate biopolümeeride klasside - valkude ja nukleiinhapete - struktuuri ja funktsiooni uurimisele, millest esimene määrab metaboolsete reaktsioonide võimalikkuse ja teine. - spetsiifiliste valkude biosüntees. Seetõttu on selge, et molekulaarbioloogia ja biokeemia, geneetika, mikrobioloogia ja viroloogia vastavate osade vahel on võimatu selget vahet teha.
Molekulaarbioloogia tekkimine oli tihedalt seotud uute uurimismeetodite väljatöötamisega, millest on vastavates peatükkides juba juttu olnud. Koos elektronmikroskoopia ja muude mikroskoopilise tehnoloogia meetodite arenguga mängisid olulist rolli 50ndatel välja töötatud rakuliste elementide fraktsioneerimise meetodid. Need põhinesid diferentsiaaltsentrifuugimise täiustatud meetoditel (A. Claude, 1954). Selleks ajaks olid biopolümeeride eraldamiseks ja fraktsioneerimiseks juba üsna usaldusväärsed meetodid. See hõlmab eelkõige A. Tiseliuse (1937; Nobeli preemia, 1948) pakutud meetodit valkude fraktsioneerimiseks elektroforeesi abil, nukleiinhapete eraldamise ja puhastamise meetodeid (E. Key, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky jne). Paralleelselt töötati paljudes laborites üle maailma välja erinevaid kromatograafilise analüüsi meetodeid (A. Martin ja R. Sing, 1941; Nobeli preemia, 1952), mida hiljem oluliselt täiustati.
Röntgenstruktuurianalüüs on biopolümeeride struktuuri dekodeerimisel mänginud hindamatut teenust. Röntgenstruktuurianalüüsi põhiprintsiibid töötati välja Londoni ülikooli King's College'is W. Braggi juhtimisel teadlaste rühmas, kuhu kuulusid J. Bernal, A. Lonsdale, W. Astbury, J. Robertson ja teised.
Eraldi väärivad esiletõstmist Moskva Riikliku Ülikooli professori A. R. Kizeli uurimused protoplasma biokeemiast (1925 - 1929), millel oli suur tähtsus molekulaarbioloogia edasise arengu seisukohalt. Kizel tabas sügavalt juurdunud arusaama, et iga protoplasma keskmes on spetsiaalne valgukeha – plaadid, mis väidetavalt määrab ära kõik selle kõige olulisemad struktuursed ja funktsionaalsed omadused. Ta näitas, et plaadid on valk, mida leidub ainult müksomütseetides ja seejärel teatud arengujärgus ning protoplasmas ei ole konstantset komponenti – üksikut skeletivalku. Seega läks protoplasma struktuuri ja valkude funktsionaalse rolli probleemi uurimine õiget teed ja sai selle arendamiseks ruumi. Kieseli uuringud on pälvinud ülemaailmse tunnustuse, stimuleerides raku koostisosade keemia uurimist.
Leedsi ülikooli inglise kristallograaf W. Astbury kasutatud termin "molekulaarbioloogia" ilmus arvatavasti 1940. aastate alguses (enne 1945. aastat). Astbury poolt 1930. aastatel läbi viidud valkude ja DNA fundamentaalsed röntgenikiirte struktuuriuuringud olid aluseks nende biopolümeeride sekundaarstruktuuri hilisemale edukale dešifreerimisele. 1963. aastal kirjutas J. Bernal: "Temale püstitab ausamba kogu molekulaarbioloogia - teadus, mille ta nimetas ja mille ta tegelikult rajas" *. orgaaniliste ja fibrillaarsete ühendite analüüs ", avaldatud inglise ajakirjas" Nature "** . Astbury (1950) märkis oma Harvey loengus: "Mul on hea meel, et nüüd kasutatakse terminit molekulaarbioloogia juba laialdaselt, kuigi on ebatõenäoline, et ma selle esimest korda välja pakkusin. See meeldis mulle ja olen pikka aega püüdnud seda levitada." Juba 1950. aastal oli Astbury selge, et molekulaarbioloogia tegeleb eelkõige makromolekulide struktuuri ja konformatsiooniga, mille uurimine on elusorganismide toimimise mõistmisel ülioluline.
* (Biogr. Mem. Sõbrad Roy. Soc, 1963, v. 9, 29.)
** (W. T. Astbury. Orgaaniliste ja kiudstruktuuride röntgenanalüüsi edenemine.- Loodus ,. 1946, v. 157, 121.)
*** (W. T. Astbury. Seiklused molekulaarbioloogias. Thomas Springfield, 1952, lk. 3.)
Molekulaarbioloogial olid ja seisavad silmitsi tegelikult samad ülesanded, mis kogu bioloogial tervikuna – teadmine elu olemusest ja selle põhinähtustest, eriti nagu pärilikkus ja muutlikkus. Kaasaegne molekulaarbioloogia on mõeldud eelkõige geenide struktuuri ja funktsiooni, organismide geneetilise informatsiooni realiseerumise viiside ja mehhanismide dešifreerimiseks ontogeneesi erinevates etappides ja selle lugemise erinevates etappides. Selle eesmärk on paljastada geenide aktiivsuse ja rakkude diferentseerumise reguleerimise peenmehhanismid, selgitada mutageneesi olemust ja evolutsiooniprotsessi molekulaarset alust.
Järgmised avastused olid molekulaarbioloogia arengu seisukohalt suurima tähtsusega. 1944. aastal näitasid Ameerika teadlased O. Avery, K. McLeod (Nobeli preemia, 1923) ja M. McCarthy, et pneumokokkidest eraldatud DNA molekulidel on transformeeriv toime. Pärast nende DNA-de hüdrolüüsi desoksüribonukleaasiga kadus nende transformeeriv aktiivsus täielikult. Nii tõestati esimest korda veenvalt, et rakus on geneetilised funktsioonid DNA, mitte valgud.
Ausalt öeldes tuleb märkida, et bakterite transformatsiooni nähtus avastati palju varem kui Avery, McLeodi ja McCarthy avastused. 1928. aastal avaldas F. Griffith artikli, milles ta teatas, et pärast kapseldatud virulentse tüve tapetud rakkude lisamist mittevirulentsetele (mittekapseldatud) pneumokokkidele muutub saadud rakkude segu hiirtele saatuslikuks. Lisaks olid selle seguga nakatunud loomadelt eraldatud pneumokokkide elusrakud juba virulentsed ja neil oli polüsahhariidkapsel. Seega näidati selles katses, et tapetud pneumokokirakkude mõnede komponentide mõjul muudetakse kapseldamata bakterite vorm kapsleid moodustavaks virulentseks vormiks. 16 aastat hiljem asendasid Avery, McLeod ja McCarthy selles katses surmatud terved pneumokokirakud nende desoksüribonukleiinhappega ja näitasid, et DNA-l on transformeeriv toime (vt ka peatükke 7 ja 25). Selle avastuse tähtsust on vaevalt võimalik üle hinnata. See stimuleeris nukleiinhapete uurimist paljudes laborites üle maailma ja pani teadlased keskenduma DNA-le.
Koos Avery, McLeodi ja McCarthy avastamisega oli 50. aastate alguseks kogunenud juba üsna palju otseseid ja kaudseid tõendeid selle kohta, et nukleiinhapetel on elus eksklusiivne roll ja neil on geneetiline funktsioon. Eelkõige viitas sellele DNA lokaliseerimise iseloom rakus ja R. Vendreli (1948) andmed, et DNA sisaldus raku kohta on rangelt konstantne ja korrelatsioonis ploidsuse astmega: haploidsetes sugurakkudes DNA on poole väiksem kui diploidsetes somaatilistes rakkudes. DNA geneetilist rolli toetas ka selle väljendunud metaboolne stabiilsus. 50. aastate alguseks oli kogunenud palju erinevaid fakte, mis näitasid, et enamik teadaolevatest mutageensetest teguritest toimivad peamiselt nukleiinhapetele ja eriti DNA-le (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 jne).
Nukleiinhapete geneetilise rolli kindlakstegemisel oli erilise tähtsusega erinevate faagide ja viiruste uurimine. 1933. aastal leidis D. Schlesinger Escherichia coli bakteriofaagist DNA. Alates W. Stanley (1935, Nobeli preemia, 1946) isoleerimisest tubaka mosaiikviirusest (TMV) kristallilises olekus algas taimeviiruste uurimises uus etapp. Aastatel 1937-1938. Rothamsteadi põllumajandusjaama (Inglismaa) töötajad F. Bowden ja N. Peary näitasid, et paljud nende eraldatud taimeviirused ei ole globuliinid, vaid on ribonukleoproteiinid ja sisaldavad olulise komponendina nukleiinhapet. 40. aastate alguses avaldati G. Schrammi (1940), PA Agatovi (1941), G. Milleri ja W. Stanley (1941) tööd, mis näitavad, et valgukomponendi märgatav keemiline modifikatsioon ei too kaasa. TMV nakkavuse kadumiseni. See näitas, et valgukomponent ei saa olla viiruse pärilike omaduste kandja, nagu paljud mikrobioloogid jätkuvalt uskusid. Veenvad tõendid nukleiinhappe (RNA) geneetilise rolli kasuks taimeviiruste puhul said 1956. aastal G. Schramm Tübingenis (Saksamaa) ja H. Frenkel-Konrath Californias (USA). Need teadlased eraldasid peaaegu samaaegselt ja üksteisest sõltumatult TMV-st RNA ja näitasid, et see, mitte valk, omab nakkavust: tubakataimede nakatumise tulemusena selle RNA-ga moodustusid ja paljunesid neis normaalsed viirusosakesed. . See tähendas, et RNA sisaldab teavet kõigi viiruskomponentide, sealhulgas viirusvalgu sünteesiks ja kokkupanekuks. 1968. aastal tegi I. G. Atabekov kindlaks, et valk mängib olulist rolli taimede enda nakatumisel – valgu iseloom määrab peremeestaimede spektri.
1957. aastal viis Frenkel-Konrat esimest korda läbi TMV rekonstrueerimise selle koostisosadest - RNA-st ja valkudest. Koos tavaliste osakestega sai ta segatud "hübriide", milles RNA oli ühest ja valk teisest tüvest. Selliste hübriidide pärilikkus määrati täielikult RNA abil ja viiruste järglased kuulusid tüvesse, mille RNA-d kasutati algsete segaosakeste saamiseks. Hiljem näitasid A. Gireri, G. Schusteri ja G. Schrammi (1958) ning G. Vitmani (1960-1966) katsed, et TMV nukleiinhappekomponendi keemiline modifitseerimine viib selle viiruse erinevate mutantide ilmnemiseni.
1970. aastal tegid D. Baltimore ja G. Temin kindlaks, et geneetilise informatsiooni ülekandmine võib toimuda mitte ainult DNA-st RNA-sse, vaid ka vastupidi. Nad leidsid mõnedes onkogeensetes RNA-d sisaldavates viirustes (onkornaviirustes) spetsiaalse ensüümi, nn pöördtranskriptaasi, mis on võimeline komplementaarselt sünteesima DNA-d RNA ahelatel. See suur avastus võimaldas mõista RNA-d sisaldavate viiruste geneetilise informatsiooni peremeesgenoomi sisestamise mehhanismi ja vaadata värske pilguga nende onkogeense toime olemust.
Termini nukleiinhapped võttis kasutusele Saksa biokeemik R. Altmann 1889. aastal pärast seda, kui Šveitsi arst F. Miescher avastas need ühendid 1869. aastal. Miescher ekstraheeris mädarakke mitu nädalat lahjendatud vesinikkloriidhappega ja sai ülejäänud osast peaaegu puhta tuumamaterjali. Ta pidas seda materjali raku tuumade iseloomulikuks "aineks ja nimetas seda nukleiiniks. Oma omaduste poolest erines nukleiin valkudest järsult: oli happelisem, ei sisaldanud väävlit, kuid sisaldas palju fosforit, lahustus hästi leelistes. , kuid ei lahustunud lahjendatud hapetes.
Misher saatis oma nukleiini vaatluste tulemused F. Hoppe-Seilerile ajakirjas avaldamiseks. Tema kirjeldatud aine oli nii ebatavaline (tollal oli kõigist bioloogilistest fosforit sisaldavatest ühenditest teada vaid letsitiin), et Hoppe-Seiler ei uskunud Mischeri katseid, tagastas talle käsikirja ning juhendas kolleege N. Ploshi ja N. Ljubavin, et kontrollida oma järeldusi muu materjali kohta ... Misheri töö "Mädarakkude keemilisest koostisest" ilmus kaks aastat hiljem (1871). Samal ajal avaldati Hoppe-Seileri ja tema kaastöötajate tööd mädarakkude, lindude, madude ja teiste rakkude erütrotsüütide koostisest. Järgmise kolme aasta jooksul eraldati nukleiin loomarakkudest ja pärmist.
Misher märkis oma töös, et erinevate nukleiinide üksikasjalik uurimine võib viia nendevaheliste erinevuste tuvastamiseni, aimates seeläbi ideed nukleiinhapete spetsiifilisusest. Lõhepiima uurides leidis Miescher, et nukleiin on soola kujul ja on seotud aluselise valguga, mida ta nimetas protamiiniks.
1879. aastal asus A. Kossel Hoppe-Seileri laboris nukleiini uurima. 1881. aastal eraldas ta nukleiinist hüpoksantiini, kuid toona kahtles ta veel selle aluse päritolus ja uskus, et hüpoksantiin võib olla valkude lagunemise saadus. 1891. aastal avastas Kossel nukleiinide hüdrolüüsi saaduste hulgast adeniini, guaniini, fosforhappe ja veel ühe suhkruomadustega aine. Nukleiinhapete keemia alaste uuringute eest pälvis Kossel 1910. aastal Nobeli preemia.
Edasisi edusamme nukleiinhapete struktuuri dešifreerimisel seostatakse P. Levini ja kolleegide (1911 - 1934) uurimistööga. 1911. aastal tuvastasid P. Levin ja V. Jacobs adenosiini ja guanosiini süsivesikute komponendi; nad leidsid, et D-riboos on osa nendest nukleosiididest. 1930. aastal näitas Levin, et desoksüribonukleosiidide süsivesikute komponent on 2-deoksü-D-riboos. Tema töödest sai teada, et nukleiinhapped koosnevad nukleotiididest, st fosforüülitud nukleosiididest. Levin uskus, et nukleiinhapete (RNA) sidemete peamine tüüp on 2", 5" -fosfodiesterside. See seisukoht osutus valeks. Tänu inglise keemiku A. Toddi (Nobeli preemia, 1957) ja tema kaastöötajate ning inglise biokeemikute R. Markhami ja J. Smithi tööle sai 50. aastate alguses teatavaks, et RNA-s on sidemete peamine tüüp. on 3 ", 5" - fosfodiesterside.
Levin näitas, et erinevad nukleiinhapped võivad süsivesikute komponendi olemuse poolest erineda: mõned neist sisaldavad suhkru desoksüriboosi, teised aga riboosi. Lisaks erinesid need kahte tüüpi nukleiinhapped ühe aluse olemuse poolest: pentoosi tüüpi nukleiinhapped sisaldasid uratsiili ja desoksüpentoosi tüüpi nukleiinhapped tümiini. Deoksüpentoosnukleiinhape (kaasaegses terminoloogias desoksüribonukleiinhape - DNA) oli tavaliselt vasikate harknäärest (harknäärest) suurtes kogustes kergesti eraldatav. Seetõttu nimetatakse seda tümonukleiinhappeks. Pentoosi tüüpi nukleiinhappe (RNA) allikaks olid peamiselt pärm ja nisuidud. Seda tüüpi nimetatakse sageli pärmi nukleiinhappeks.
1930. aastate alguses juurdus üsna kindlalt mõte, et pärmi tüüpi nukleiinhape on omane taimerakkudele, tümonukleiinhape aga ainult loomarakkude tuumadele. Kahte tüüpi nukleiinhappeid – RNA ja DNA – nimetati vastavalt taimseteks ja loomseteks nukleiinhapeteks. Kuid nagu näitasid A. N. Belozersky varased uuringud, on selline nukleiinhapete jaotus põhjendamatu. 1934. aastal avastas Belozersky esmakordselt tümonukleiinhappe taimerakkudes: herneseemnetest eraldas ja tuvastas DNA-le iseloomuliku tümiinpürimidiini aluse. Siis avastas ta tümiini teistes taimedes (sojaoa seemned, oad). 1936. aastal eraldasid A. N. Belozersky ja I. I. Dubrovskaja hobukastani seemikutelt preparatiivse DNA. Lisaks näitasid D. Davidsoni ja tema kolleegide poolt 1940. aastatel Inglismaal tehtud tööd veenvalt, et taimne nukleiinhape (RNA) sisaldub paljudes loomarakkudes.
R. Felgeni ja G. Rosenbecki (1924) välja töötatud tsütokeemilise reaktsiooni DNA-le ja J. Brachet (1944) reaktsiooni RNA-le laialdane kasutamine võimaldas üsna kiiresti ja ühemõtteliselt lahendada domineeriva lokaliseerimise küsimuse. nendest nukleiinhapetest rakus. Selgus, et DNA on koondunud tuuma, RNA aga peamiselt tsütoplasmasse. Hiljem selgus, et RNA sisaldub nii tsütoplasmas kui ka tuumas ning lisaks tuvastati tsütoplasmaatiline DNA.
Mis puudutab nukleiinhapete primaarstruktuuri küsimust, siis 40. aastate keskpaigaks oli teaduses kindlalt kinnistunud P. Levini idee, mille kohaselt on kõik nukleiinhapped üles ehitatud sama tüübi järgi ja koosnevad samadest, nii et nimetatakse tetranukleotiidplokkideks. Kõik need plokid sisaldavad Levini sõnul nelja erinevat nukleotiidi. Nukleiinhapete struktuuri tetranukleotiiditeooria jättis need biopolümeerid suures osas spetsiifilisusest ilma. Seetõttu pole üllatav, et kogu elusolendite eripära seostati tollal ainult valkudega, mille monomeeride olemus on palju mitmekesisem (20 aminohapet).
Esimese lünga nukleiinhapete tetranukleotiidse struktuuri teooriasse tegid inglise keemiku J. Gulandi (1945 - 1947) analüütilised andmed. Nukleiinhapete koostise määramisel aluste lämmastikuga ei saanud ta aluste ekvimolaarset suhet, nagu see Levini teooria järgi oleks pidanud olema. Lõpuks kukkus E. Chargaffi ja tema kaastööliste (1949 - 1951) uurimistöö tulemusena kokku tetranukleotiiditeooria nukleiinhapete struktuurist. Happelise hüdrolüüsi tulemusena DNA-st lõhustunud aluste eraldamiseks kasutas Chargaff paberkromatograafiat. Kõik need alused määrati täpselt spektrofotomeetriliselt. Chargaff märkas olulisi kõrvalekaldeid ekvimolaarsest alussuhtest erineva päritoluga DNA-s ja väitis esimest korda kindlalt, et DNA-l on väljendunud liigispetsiifilisus. Seega lõppes valgu spetsiifilisuse kontseptsiooni hegemoonia elusrakus. Erineva päritoluga DNA-d analüüsides avastas ja sõnastas Chargaff ainulaadsed DNA koostise mustrid, mis jõudsid teadusesse Chargaffi reeglite nime all. Nende reeglite kohaselt on kogu DNA-s sõltumata päritolust adeniini kogus võrdne tümiini kogusega (A = T), guaniini kogus tsütosiini kogusega (G = C), puriinid on võrdne pürimidiinide kogusega (G + A = C + T), 6-aminorühmadega aluste kogus võrdub 6-ketorühmadega aluste arvuga (A + C = G + T). Samal ajal, hoolimata sellistest rangetest kvantitatiivsetest vastavustest, erineb erinevate liikide DNA suhte A + T: G + C väärtuses. Mõnes DNA-s domineerib guaniini ja tsütosiini kogus adeniini ja tümiini koguse üle (Chargaff nimetas neid DNA-d GC-tüüpi DNA-ks); teised DNA-d sisaldasid rohkem adeniini ja tümiini kui guaniini ja tsütosiini (neid DNA-sid nimetati AT-tüüpi DNA-ks). Chargaffi saadud andmed DNA koostise kohta mängisid molekulaarbioloogias erakordset rolli. Need olid 1953. aastal J. Watsoni ja F. Cricki poolt tehtud DNA struktuuri avastamise aluseks.
1938. aastal näitasid W. Astbury ja F. Bell röntgendifraktsioonianalüüsi kasutades, et DNA alustasandid peaksid olema risti molekuli pikiteljega ja sarnanema justkui plaatide virnaga, mis asetsevad üksteise kohal. teine. Röntgenstruktuurianalüüsi tehnika täiustamisega aastatel 1952–1953. on kogunenud teavet, mis võimaldas hinnata üksikute sidemete pikkust ja kaldenurki. See võimaldas suurima tõenäosusega kujutada pentoosijääkide tsüklite orientatsiooni olemust DNA molekuli suhkru-fosfaatkarkassis. 1952. aastal pakkus S. Farberg välja kaks DNA spekulatiivset mudelit, mis kujutasid üheahelalist molekuli, mis oli kokkuvolditud või keerdunud enda külge. Samavõrd spekulatiivse DNA struktuuri mudeli pakkusid 1953. aastal välja L. Pauling (Nobeli preemia laureaat, 1954) ja R. Corey. Selles mudelis moodustasid kolm keerdunud DNA ahelat pika spiraali, mille südamikku esindasid fosfaatrühmad ja alused asusid sellest väljaspool. 1953. aastaks said M. Wilkins ja R. Franklin selgemad DNA röntgendifraktsioonimustrid. Nende analüüs näitas Farbergi, Paulingu ja Corey mudelite täielikku vastuolu. Chargaffi andmeid kasutades, kõrvutades üksikute monomeeride molekulaarmudelite erinevaid kombinatsioone ja röntgenstruktuurianalüüsi andmeid, jõudsid J. Watson ja F. Crick 1953. aastal järeldusele, et DNA molekul peab olema kaheahelaline spiraal. Chargaffi reeglid piirasid järsult võimalike järjestatud aluskombinatsioonide arvu pakutud DNA mudelis; nad tegid Watsonile ja Crickile ettepaneku, et DNA molekulil peab olema spetsiifiline aluspaar – adeniin tümiiniga ja guaniin tsütosiiniga. Teisisõnu, adeniin ühes DNA ahelas vastab alati rangelt tümiinile teises ahelas ja guaniin ühes ahelas vastab tingimata tsütosiinile teises ahelas. Seega sõnastasid Watson ja Crick esimestena DNA komplementaarse struktuuri ülimalt olulise põhimõtte, mille kohaselt üks DNA ahel komplementeerib teist, st ühe ahela alusjärjestus määrab unikaalselt alusjärjestuse teises (komplementaarses) ahelas. . Selgus, et DNA struktuur sisaldab potentsiaali selle täpseks reprodutseerimiseks. See DNA struktuuri mudel on nüüdseks üldtunnustatud. Crick, Watson ja Wilkins said 1962. aastal Nobeli preemia DNA struktuuri dešifreerimise eest.
Tuleb märkida, et idee makromolekulide täpse reprodutseerimise ja päriliku teabe edastamise mehhanismi kohta pärineb meie riigist. 1927. aastal pakkus N, K. Koltsov välja, et rakkude paljunemise ajal toimub molekulide paljunemine olemasolevate lähtemolekulide täpse autokatalüütilise reprodutseerimise teel. Tõsi, tol ajal ei varustas Koltsov seda omadust mitte DNA molekulidega, vaid valgumolekulidega, mille funktsionaalset tähtsust tol ajal ei teatud. Sellegipoolest osutus juba idee makromolekulide autokatalüütilisest paljunemisest ja pärilike omaduste edasikandumise mehhanismist prohvetlikuks: sellest sai kaasaegse molekulaarbioloogia juhtidee.
A.S.Spirin, G.N. Zaitseva, B.F. Vanyushin, S.O. Uryson, A.S. erinevad organismid kinnitasid täielikult Chargaffi avastatud mustreid ja täielikku vastavust Watsoni ja Cricki pakutud DNA struktuuri molekulaarsele mudelile. Need uuringud on näidanud, et erinevate bakterite, seente, vetikate, aktinomütseedide, kõrgemate taimede, selgrootute ja selgroogsete DNA on spetsiifilise koostisega. Erinevused koostises (AT-aluspaaride sisaldus) ilmnevad eriti selgelt mikroorganismide puhul, olles oluliseks taksonoomiliseks tunnuseks. Kõrgematel taimedel ja loomadel on DNA koostise liigilised variatsioonid palju vähem väljendunud. Kuid see ei tähenda sugugi, et nende DNA oleks vähem spetsiifiline. Lisaks aluste koostisele määrab spetsiifilisuse suuresti nende järjestus DNA ahelates.
Lisaks tavapärastele alustele leiti DNA ja RNA koostisest täiendavaid lämmastikaluseid. Nii leidis G. White (1950) taimede ja loomade DNA-st 5-metüültsütosiini ning D. Dunn ja J. Smith (1958) mõnest DNA-st metüleeritud adeniini. Pikka aega peeti metüültsütosiini kõrgemate organismide geneetilise materjali eripäraks. 1968. aastal tegid A. N. Belozersky, B. F. Vanyushin ja N. A. Kokurina kindlaks, et seda võib leida ka bakterite DNA-st.
1964. aastal avastasid M. Gold ja J. Hurwitz uue ensüümide klassi, mis loomulikult modifitseerivad DNA-d – selle metüülimise. Pärast seda avastust sai selgeks, et tsütosiini ja adeniini jääkide spetsiifilise metüülimise tulemusena spetsiaalsetes järjestustes ilmuvad vähemtähtsad (väikestes kogustes sisalduvad) alused juba valmis polünukleotiidi DNA ahelasse. Täpsemalt, B. F. Vanyušini, Ya. I. Bur'yanovi ja A. N. Belozersky (1969) andmetel võib adeniini metüülimine E. coli DNA-s toimuda terminatsioonikoodonites. ANBelozersky ja kolleegide (1968–1970), samuti M. Meselsoni (USA) ja V. Arberi (Šveits) (1965–1969) sõnul annab metüülimine DNA molekulidele ainulaadsed individuaalsed tunnused ja koostoimes spetsiifiliste ainete toimega. nukleaasid, on osa keerulisest mehhanismist, mis kontrollib DNA sünteesi rakus. Teisisõnu määrab konkreetse DNA metüülimise olemus küsimuse, kas see võib antud rakus paljuneda.
Peaaegu samal ajal algas DNA metülaaside ja restriktsiooniendonukleaaside isoleerimine ja intensiivne uurimine; aastatel 1969-1975 kindlaks tehtud nukleotiidjärjestused, mida mõned neist ensüümidest tunnevad ära DNA-s (H. Boyer, H. Smith, S. Lynn, K. Murray). Erinevate DNA-de hüdrolüüsimisel restriktsiooniensüümi toimel lõhustatakse üsna suuri ühesuguste kleepuvate otstega fragmente. See võimaldab mitte ainult analüüsida geenide struktuuri, nagu seda tehakse väikeste viiruste puhul (D. Nathans, S. Adler, 1973-1975), vaid ka konstrueerida erinevaid genoome. Nende spetsiifiliste restriktsiooniensüümide avastamisega on geenitehnoloogia muutunud käegakatsutavaks reaalsuseks. Erineva päritoluga geenid, mis on sisestatud väikestesse plasmiidsetesse DNA-desse, on juba kergesti sisestatavad erinevatesse rakkudesse. Nii saadi uut tüüpi bioloogiliselt aktiivne plasmiid, mis annab teatud antibiootikumide suhtes resistentsuse (S. Cohen, 1973), E. coli plasmiididesse viidi konna ja Drosophila ribosomaalsed geenid (J. Morrow, 1974; H. Boyer, D. Hogness, R. Davis, 1974-1975). Seega on avastatud tõelisi viise, kuidas saada põhimõtteliselt uusi organisme, lisades ja integreerides nende geenifondi erinevaid geene. See avastus võib olla suunatud kogu inimkonna hüvanguks.
1952. aastal avastasid G. White ja S. Cohen, et T-paari faagide DNA sisaldab ebatavalist alust – 5-hüdroksümetüültsütosiini. Hiljem sai E. Vol'kini ja R. Sinsheimeri (1954) ning Coheni (1956) töödest teada, et oksümetüültsütosiini jääke saab täielikult või osaliselt glükosideerida, mille tulemusena on faagi DNA molekul kaitstud hüdrolüütilise mõju eest. nukleaaside toime.
50. aastate alguses sai D. Dunni ja J. Smithi (Inglismaa), S. Zamenhofi (USA) ja A. Wackeri (Saksamaa) töödest teada, et DNA-sse saab lisada palju aluste kunstlikke analooge, mõnikord kuni 50% tümiini asendamine. Tavaliselt põhjustavad need asendused vigu replikatsioonis, DNA transkriptsioonis ja translatsioonis ning mutantide teket. Nii tegi J. Marmur (1962) kindlaks, et mõne faagi DNA sisaldab tümiini asemel oksümetüüluratsiili. 1963. aastal avastasid I. Takahashi ja J. Marmur, et ühe faagi DNA sisaldab tümiini asemel uratsiili. Seega on kokku kukkunud veel üks põhimõte, mille järgi nukleiinhappeid varem eraldati. Alates P. Levini tööajast arvati, et DNA tunnus on tümiin ja RNA on uratsiil. Sai selgeks, et see omadus ei ole alati usaldusväärne ja põhimõtteline erinevus kahe nukleiinhapete tüübi keemilises olemuses, nagu siiani tundub, seisneb ainult süsivesikute komponendi olemuses.
Faagide uurimisel avastati palju ebatavalisi märke nukleiinhapete organiseerimisest. Alates 1953. aastast on arvatud, et kogu DNA on kaheahelalised lineaarsed molekulid ja RNA on ainult üheahelaline. Olukorda raputas oluliselt 1961. aastal, kui R. Sinsheimer avastas, et faagi φ X 174 DNA on esindatud üheahelalise ringikujulise molekuliga. Tõsi, hiljem selgus, et sellisel kujul eksisteerib see DNA ainult vegetatiivses faagiosakeses ja ka selle faagi DNA replikatiivne vorm on kaheahelaline. Lisaks selgus üsna ootamatult, et osade viiruste RNA võib olla kaheahelaline. Seda uut tüüpi RNA makromolekulaarset organiseeritust avastasid 1962. aastal P. Gomatos, I. Tamm ja teised teadlased mõnede loomaviiruste ja taimede haavakasvaja viiruse puhul. Hiljuti tegid V. I. Agol ja A. A. Bogdanov (1970) kindlaks, et lisaks lineaarsetele RNA molekulidele on olemas ka suletud ehk tsüklilised molekulid. Nad tuvastasid tsüklilise kaheahelalise RNA, eriti entsefalomüelokardiidi viiruses. Tänu H. Devo, L. Tinoko, T. I. Tihhonenko, E. I. Budovski jt (1960 - 1974) töödele said teada bakteriofaagides oleva geneetilise materjali organiseerimise (pakendamise) põhijooned.
1950. aastate lõpus leidis Ameerika teadlane P. Doty, et kuumutamisel toimub DNA denaturatsioon, millega kaasneb aluspaaride vaheliste vesiniksidemete katkemine ja komplementaarsete ahelate lahknemine. Sellel protsessil on "spiraalmähise" faasisiire iseloom ja see meenutab kristallide sulamist. Seetõttu nimetas Doty DNA DNA termilise denatureerimise protsessi sulamiseks. Aeglasel jahutamisel toimub molekulide renaturatsioon, st komplementaarsete poolte taasühendamine.
Renaturatsiooni põhimõtet kasutasid 1960. aastal J. Marmur ja K. Shildkraut erinevate mikroorganismide DNA "hübridiseeritavuse" määra määramiseks. Seejärel täiustasid E. Bolton ja B. McCarthy seda tehnikat, pakkudes välja niinimetatud DNA-agari kolonnide meetodi. See meetod osutus asendamatuks erinevate DNA-de nukleotiidjärjestuse homoloogia astme uurimisel ja erinevate organismide geneetilise seose selgitamisel. Doty DNA avatud denatureerimine kombinatsioonis J. Mandeli ja A. Hershey* (1960) poolt kirjeldatud kromatograafiaga metüülitud albumiinil ja tsentrifuugimisega tihedusgradiendis (meetodi töötasid välja 1957. aastal M. Meselson, F. Stahl ja D. Vinograd) kasutatakse laialdaselt üksikute komplementaarsete DNA ahelate eraldamiseks, eraldamiseks ja analüüsimiseks. Näiteks V. Shibalski (USA), kasutades neid meetodeid lambda faagi DNA eraldamiseks, näitas aastatel 1967–1969, et mõlemad faagiahelad on geneetiliselt aktiivsed. , ja mitte üks, nagu seda arvati (S. Spigelman, 1961). Tuleb märkida, et idee lambda-faagi mõlema DNA ahela geneetilisest tähtsusest väljendas esmakordselt NSV Liidus S.E.Bresler (1961).
* (A. Hershey koos M. Delbrücki ja S. Luriaga pälvis 1969. aasta Nobeli preemia bakterite ja viiruste geneetika alase töö eest.)
DNA nukleotiidjärjestuse määramine on genoomi organisatsiooni ja funktsionaalse aktiivsuse mõistmiseks ülimalt tähtis. Sellise määramise meetodeid otsitakse paljudes laborites üle maailma. USA-s on M. Beer ja ta kolleegid püüdnud elektronmikroskoopiat kasutades DNA järjestust kindlaks teha juba 1950. aastate lõpust, kuid seni edutult. 50. aastate alguses sai Sinsheimeri, Chargaffi ja teiste DNA ensümaatilise lagunemise uurijate esimestest töödest teada, et DNA molekulis on erinevad nukleotiidid jaotunud, ehkki mittekaootiliselt, kuid ebaühtlaselt. Briti keemiku K. Bartoni (1961) järgi on pürimidiinid (neist üle 70%) kontsentreeritud peamiselt vastavate plokkide kujul. A. L. Mazin ja B. F. Vanyushin (1968–1969) tegid kindlaks, et erinevatel DNA-del on pürimidiinide kohesioon erineval määral ja loomorganismide DNA-s suureneb see märkimisväärselt üleminekul madalamalt kõrgemale. Seega peegeldub organismide areng nende genoomide struktuuris. Seetõttu on evolutsiooniprotsessi kui terviku mõistmiseks eriti oluline nukleiinhapete struktuuri võrdlev uuring. Bioloogiliselt oluliste polümeeride ja ennekõike DNA struktuuri analüüs on äärmiselt oluline paljude spetsiifiliste fülogeneetika ja taksonoomia küsimuste lahendamiseks.
Huvitav on märkida, et inglise füsioloog E. Lankester, kes uuris molluskite hemoglobiine, aimas molekulaarbioloogia ideid täpselt 100 aastat tagasi, kirjutas: Kui suudaksime selgelt kindlaks teha erinevused organismide molekulaarses korralduses ja toimimises, suudaks palju paremini mõista erinevate organismide päritolu ja evolutsiooni kui morfoloogiliste vaatluste põhjal "*. Biokeemiliste uuringute tähtsust süstemaatikale rõhutas ka V.L.
* (E. R. Lankester. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen. – "Pfluger" Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)
** (V. L. Komarov. Valitud teosed, kd 1. M.-L., ENSV Teaduste Akadeemia Kirjastus, 1945, lk 331.)
A. V. Blagoveštšenski ja S. L. Ivanov astusid meie riigis esimesi samme 1920. aastatel, et selgitada mõningaid organismide evolutsiooni ja süstemaatika küsimusi nende biokeemilise koostise võrdleva analüüsi põhjal (vt ptk 2). Valkude ja nukleiinhapete struktuuri võrdlev analüüs on praegu muutumas taksonoomide jaoks üha käegakatsutavamaks abivahendiks (vt ptk 21). See molekulaarbioloogia meetod võimaldab mitte ainult selgitada üksikute liikide asukohta süsteemis, vaid paneb meid ka uue pilguga vaatama organismide klassifitseerimise põhimõtteid ja mõnikord vaatama üle kogu süsteemi kui terviku. juhtus näiteks mikroorganismide taksonoomiaga. Kahtlemata on tulevikus organismide kemosüstemaatikas kesksel kohal genoomi struktuuri analüüs.
DNA replikatsiooni ja transkriptsiooni mehhanismide dešifreerimine oli molekulaarbioloogia arengu seisukohalt väga oluline (vt ptk 24).
Olulist nihet valkude biosünteesi probleemi lahendamisel seostatakse edusammudega nukleiinhapete uurimisel. 1941. aastal juhtisid T. Casperson (Rootsi) ja 1942. aastal J. Brachet (Belgia) tähelepanu asjaolule, et aktiivse valgusünteesiga koed sisaldavad suurenenud RNA-d. Nad jõudsid järeldusele, et ribonukleiinhapped mängivad valkude sünteesis otsustavat rolli. 1953. aastal näisid E. Gale ja D. Fox olevat saanud otseseid tõendeid RNA otsesest osalemisest valkude biosünteesis: nende andmetel pärssis ribonukleaas märkimisväärselt aminohapete kaasamist bakteriraku lüsaatidesse. Sarnased andmed said V. Alfrey, M. Delhi ja A. Mirsky (1953) maksa homogenaatide kohta. Hiljem lükkas E. Gale tagasi tema poolt väljendatud õige mõtte RNA juhtivast rollist valgusünteesis, uskudes ekslikult, et valgusünteesi aktiveerumine rakuvabas süsteemis toimus mõne muu tundmatu olemusega aine mõjul. 1954. aastal leidsid P. Zamechnik, D. Littlefield, RB Khesin-Lurie jt, et aminohapete kõige aktiivsem kaasamine toimub subtsellulaarsete osakeste RNA-rikastes fraktsioonides - mikrosoomides. P. Zamechnik ja E. Keller (1953-1954) leidsid, et aminohapete inkorporeerimine paranes supernatandi fraktsiooni juuresolekul ATP regeneratsiooni tingimustes märkimisväärselt. P. Sikewitz (1952) ja M. Hoagland (1956) eraldasid supernatandist valgufraktsiooni (pH 5 fraktsioon), mis oli vastutav aminohapete mikrosoomidesse lisamise järsu stimuleerimise eest. Koos valkudega leiti supernatandist eriklass madala molekulmassiga RNA-sid, mida nüüd nimetatakse transpordi-RNA-deks (tRNA-deks). 1958. aastal avastasid Hoagland ja Zamechnik, samuti P. Berg, R. Sweet ja F. Allen ning paljud teised teadlased, et iga aminohappe aktiveerimiseks on vaja oma spetsiaalset ensüümi, ATP-d ja spetsiifilist tRNA-d. Selgus, et tRNA-d täidavad eranditult adapterite ehk adaptatsioonide funktsiooni, mis leiavad nukleiinhappemaatriksil (mRNA) vastava aminohappe koha moodustavas valgumolekulis. Need uuringud kinnitasid täielikult F. Cricki (1957) adapteri hüpoteesi, mis nägi ette polünukleotiidadapterite olemasolu rakus, mis on vajalikud sünteesitava valgu aminohappejääkide õigeks paigutuseks nukleiinmaatriksil. Palju hiljem näitas prantsuse teadlane F. Chapville (1962) USA-s F. Lipmani laboris (Nobeli preemia, 1953) väga vaimukalt ja ühemõtteliselt, et aminohappe asukoha sünteesitud valgu molekulis määrab täielikult spetsiifiline tRNA, millega see on seotud. Cricki adapteri hüpoteesi töötasid välja Hoagland ja Zamechnik.
1958. aastaks said teatavaks järgmised valgusünteesi põhietapid: 1) aminohappe aktiveerimine spetsiifilise ensüümi poolt "pH 5 fraktsioonist" ATP juuresolekul aminoatsüüladenülaadi moodustumisega; 2) aktiveeritud aminohappe kinnitumine spetsiifilisele tRNA-le koos adenosiinmonofosfaadi (AMP) vabanemisega; 3) aminoatsüül-tRNA (aminohappega laetud tRNA) sidumine mikrosoomidega ja aminohapete liitmine valku koos tRNA vabanemisega. Hoagland (1958) märkis, et guanosiintrifosfaat (GTP) on vajalik valgusünteesi viimases etapis.
Pärast tRNA avastamist algas aktiivne nende fraktsioneerimise otsimine ja nukleotiidjärjestuse määramine. Suurima edu saavutas Ameerika biokeemik R. Holly. 1965. aastal tegi ta kindlaks pärmi alaniini tRNA struktuuri. Kasutades ribonukleaase (guanüül-RNAas ja pankrease RNAas), jagas Holly nukleiinhappemolekuli mitmeks fragmendiks, määras igaühes neist eraldi nukleotiidjärjestuse ja seejärel rekonstrueeris kogu alaniini tRNA molekuli järjestuse. Sellist nukleotiidjärjestuse analüüsimeetodit nimetatakse plokkmeetodiks. Holly teene seisnes peamiselt selles, et ta õppis jagama RNA molekuli mitte ainult väikesteks tükkideks, nagu paljud enne teda olid teinud, vaid ka suurteks fragmentideks (veeranditeks ja pooleks). See andis talle võimaluse üksikud väikesed tükid õigesti kokku panna ja seeläbi kogu tRNA molekuli täielik nukleotiidjärjestus uuesti luua (Nobeli preemia, 1968).
Selle tehnika võtsid kohe kasutusele paljud laborid üle maailma. Järgmise kahe aasta jooksul dešifreeriti NSV Liidus ja välismaal mitme tRNA esmane struktuur. A. A. Baev (1967) ja kolleegid olid esimesed, kes määrasid nukleotiidide järjestuse pärmi valiini tRNA-s. Praeguseks on uuritud enam kui tosinat erinevat individuaalset tRNA-d. Omamoodi rekordi nukleotiidjärjestuse määramisel püstitasid Cambridge'is F. Senger ja G. Brownlee. Need teadlased töötasid välja üllatavalt elegantse meetodi oligonukleotiidide eraldamiseks ja määrasid kindlaks niinimetatud 5S (ribosomaalse) RNA järjestuse E. coli rakkudest (1968). See RNA koosneb 120 nukleotiidi jäägist ja erinevalt tRNA-st ei sisalda täiendavaid väiksemaid aluseid, mis hõlbustavad oluliselt nukleotiidjärjestuse analüüsi, toimides ainulaadsete orientiiridena molekuli üksikute fragmentide jaoks. Praegu edeneb J. Ebeli (Prantsusmaa) ja teiste teadlaste laboris tänu Sangeri ja Brownlee meetodi kasutamisele edukalt töö pikkade ribosomaalsete RNA-de ja mõnede viiruse RNA-de järjestuse uurimisel.
AA Baev jt (1967) leidsid, et pooleks lõigatud valiini tRNA taastab lahuses oma makromolekulaarse struktuuri ja vaatamata primaarstruktuuri defektile on sellel algse (natiivse) molekuli funktsionaalne aktiivsus. Selline lähenemine – lõigatud makromolekuli rekonstrueerimine pärast teatud fragmentide eemaldamist – osutus väga paljulubavaks. Nüüd kasutatakse seda laialdaselt teatud tRNA-de üksikute piirkondade funktsionaalse rolli selgitamiseks.
Viimastel aastatel on üksikute tRNA-de kristalsete preparaatide valmistamisel saavutatud suurt edu. Nüüd on mitmes USA ja Inglismaa laboris paljud tRNA-d juba kristalliseerunud. See võimaldas uurida tRNA struktuuri röntgenstruktuurianalüüsi abil. 1970. aastal esitles R. Bock Wisconsini ülikoolis tema loodud mitme tRNA esimesi röntgendifraktsioonimustreid ja kolmemõõtmelisi mudeleid. Need mudelid aitavad määrata tRNA üksikute funktsionaalselt aktiivsete saitide lokaliseerimist ja mõista nende molekulide toimimise põhiprintsiipe.
Valgusünteesi mehhanismi paljastamisel ja valgu sünteesi probleemi lahendamisel oli ülimalt oluline geneetilise koodi olemuse lahtimõtestamine (vt ptk 24), mida võib liialdamata pidada loodusteaduste juhtivaks vallutusretkeks 20. sajandil. selle protsessi spetsiifilisus.
R. Holly avalikustamine tRNA primaarstruktuuri kohta andis tõuke G. Korana * (USA) töödele oligonukleotiidide sünteesi kohta ja suunas need spetsiifilise bioloogilise struktuuri – alaniini tRNA-d kodeeriva DNA molekuli – sünteesile. Peaaegu 15 aastat tagasi Koraaniga tehtud lühikeste oligonukleotiidide keemilise sünteesi esimesed sammud viidi lõpule 1970. aastal geeni esimese sünteesiga. Korana ja tema kaastöötajad sünteesisid kõigepealt keemiliste vahenditega üksikutest nukleotiididest koosnevad lühikesed 8–12 nukleotiidijäägi fragmendid. Need antud nukleotiidjärjestusega fragmendid moodustasid spontaanselt kaheahelalisi komplementaarseid tükke, mis kattusid 4-5 nukleotiidi ulatuses. Seejärel ühendati need soovitud järjekorras valmis tükid vaheldumisi otsast otsani, kasutades ensüümi DNA ligaasi. Seega, erinevalt DNA molekulide replikatsioonist, suutis Koraan A. Kornbergi ** (vt ptk 24) järgi eelnevalt kavandatud programmi kohaselt uuesti luua loodusliku kaheahelalise DNA molekuli vastavalt tRNA järjestust kirjeldas Holly. Samamoodi töötatakse praegu ka teiste geenide sünteesiga (MN Kolosov, Z. A. Shabarova, DG Knorre, 1970-1975).
* (Geneetilise koodi uurimise eest pälvisid G. Korana ja M. Nirenberg 1968. aastal Nobeli preemia.)
** (Polümeraasi ja DNA sünteesi avastamise eest pälvis A. Kornberg ning RNA sünteesi eest S. Ochoa 1959. aastal Nobeli preemia.)
1950. aastate keskel usuti, et mikrosoomid on rakus valgusünteesi keskpunkt. Termini mikrosoomid võttis esmakordselt kasutusele 1949. aastal A. Claude, et tähistada väikeste graanulite fraktsiooni. Hiljem selgus, et valgusünteesi eest ei vastuta mitte kogu mikrosoomide fraktsioon, mis koosneb membraanidest ja graanulitest, vaid ainult väikesed ribonukleoproteiini osakesed. Need osakesed nimetasid 1958. aastal R. Robertsi ribosoomideks.
Klassikalisi bakteriaalsete ribosoomide uuringuid viisid läbi A. Tissier ja J. Watson aastatel 1958–1959. Bakterite ribosoomid leiti olevat mõnevõrra väiksemad kui taimed ja loomad. J. Littleton (1960), M. Clarke (1964) ja E.N.Svetailo (1966) näitasid, et kõrgemate taimede ja mitokondrite kloroplastide ribosoomid kuuluvad bakteritüüpi. A. Tissier ja teised (1958) leidsid, et ribosoomid dissotsieeruvad kaheks ebavõrdseks subühikuks, mis sisaldavad ühte RNA molekuli. 1950. aastate lõpus arvati, et iga ribosomaalse RNA molekul koosneb mitmest lühikesest fragmendist. A.S.Spirin näitas aga 1960. aastal esimest korda, et alamosakestes olevat RNA-d esindab pidev molekul. D. Waller (1960), eraldades tärklisegeelelektroforeesi abil ribosomaalseid valke, leidis, et need on väga heterogeensed. Alguses kahtlesid paljud Walleri andmetes, kuna tundus, et ribosoomivalk peaks olema rangelt homogeenne, näiteks TMV valk. Praeguseks on D. Walleri, R. Trouti, P. Traubi ja teiste biokeemikute uuringute tulemusena saanud teatavaks, et ribosoomiosakeste koostis sisaldab enam kui 50 struktuurilt täiesti erinevat valku. A.S. Spirin oli 1963. aastal esimene, kes rullis lahti ribosomaalsed subühikud ja näitas, et ribosoomid on kompaktselt keerdunud ribonukleoproteiini ahel, mis võib teatud tingimustel lahti rulluda. 1967-1968 M. Nomura rekonstrueeris täielikult ribosomaalsest RNA-st ja valgust bioloogiliselt aktiivse subühiku ning sai isegi ribosoomid, milles valk ja RNA kuulusid erinevatele mikroorganismidele.
Siiani on ribosomaalse RNA roll ebaselge. Eeldatakse, et see on ainulaadne spetsiifiline maatriks, millel ribosomaalse osakese moodustumise ajal leiab igaüks paljudest ribosomaalsetest valkudest rangelt määratletud koha (A.S. Spirin, 1968).
A. Rich (1962) avastas mitme ribosoomi agregaadid, mis on omavahel seotud mRNA ahelaga. Neid komplekse nimetati polüsoomideks. Polüsoomide avastamine võimaldas Richil ja Watsonil (1963) oletada, et polüpeptiidahela süntees toimub ribosoomil, mis justkui liigub mööda mRNA ahelat. Kui ribosoom liigub mööda mRNA ahelat, loetakse osakest infot ja moodustub valgu polüpeptiidahel ning mRNA vabanenud lugemisotsale kinnituvad vaheldumisi uued ribosoomid. Richi ja Watsoni andmetest järeldub, et polüsoomi tähtsus rakus seisneb valgu masstootmises maatriksi järjestikuse lugemise teel mitme ribosoomi korraga.
M. Nirenbergi, S. Ochoa, F. Lipmani, G. Korana jt uuringute tulemusena 1963. - 1970. a. sai teatavaks, et koos mRNA, ribosoomide, ATP ja aminoatsüül-tRNA-ga on translatsiooniprotsessis kaasatud suur hulk erinevaid tegureid ning translatsiooniprotsessi võib tinglikult jagada kolmeks etapiks - initsiatsioon, translatsioon ise ja lõpetamine.
Translatsiooni initsiatsioon tähendab esimese peptiidsideme sünteesi ribosoomi – matriitspolünukleotiid – aminoatsüül-tRNA kompleksis. Seda initsiaatori aktiivsust ei oma mitte ükski aminoatsüül-tRNA, vaid formüülmetionüül-tRNA. Selle aine eraldasid esmakordselt 1964. aastal F. Senger ja K. Marker. S. Bretcher ja K. Marker (1966) näitasid, et formüülmetionüül-tRNA initsiaatorfunktsioon on tingitud selle suurenenud afiinsusest ribosoomi peptidüülkeskuse suhtes. Translatsiooni alguseks on ülimalt olulised ka mõned valgu initsiatsioonifaktorid, mis eraldati S. Ochoa, F. Gro ja teiste uurimiskeskuste laborites. Pärast esimese peptiidsideme moodustumist ribosoomis algab tegelik translatsioon, st aminoatsüüli jäägi järjestikune kinnitumine polüpeptiidi C-otsa. Paljusid ringhäälinguprotsessi detaile uurisid K. Monroe ja J. Bishop (Inglismaa), I. Rykhlik ja F. Schorm (Tšehhoslovakkia), F. Lipman, M. Bretcher, W. Gilbert (USA) ja teised teadlased. 1968. aastal pakkus A.S.Spirin välja algse hüpoteesi ribosoomi mehhanismi selgitamiseks. Juhtmehhanism, mis tagab translatsiooni ajal kõik tRNA ja mRNA ruumilised liikumised, on ribosoomi subühikute perioodiline avamine ja sulgemine. Translatsiooni lõpp on kodeeritud loetavas maatriksis endas, mis sisaldab terminatsioonikoodoneid. Nagu on näidanud S. Brenner (1965-1967), on sellisteks koodoniteks kolmikud UAA, UAG ja UGA. M. Capecchi (1967) tuvastas ka spetsiaalsed valgu terminatsioonifaktorid. AS Spirin ja LP Gavrilova kirjeldasid niinimetatud "mitteensümaatilist" valgusünteesi ribosoomides (1972-1975) ilma valgufaktorite osaluseta. See avastus on oluline valkude biosünteesi päritolu ja evolutsiooni mõistmiseks.
Pärast valgusünteesi spetsiifilisuse probleemi osutus molekulaarbioloogias esikohale valgusünteesi reguleerimise probleem ehk, mis on sama asi, geeniaktiivsuse reguleerimise probleem.
Rakkude funktsionaalne ebavõrdsus ning sellega kaasnev geenide allasurumine ja aktiveerimine on geneetikute tähelepanu pälvinud pikka aega, kuid kuni viimase ajani jäi geenide aktiivsuse tegelik kontrollimehhanism teadmata.
Esimesed katsed selgitada geenide regulatiivset aktiivsust olid seotud histooni valkude uurimisega. Isegi Steadmani abikaasad * XX sajandi 40ndate alguses. väljendas mõtet, et selles nähtuses võivad peamist rolli mängida histoonid. Seejärel said nad esimesed selged andmed histooni valkude keemilise olemuse erinevuste kohta. Praegu kasvab seda hüpoteesi toetavate faktide arv igal aastal.
* (E. Stedman, E. Stedman. Rakutuumade põhivalgud - Phylosoph. Trans. Roy. Soc. London, 1951, v. 235, 565-595.)
Samal ajal koguneb üha rohkem andmeid, mis näitavad, et geenide aktiivsuse reguleerimine on palju keerulisem protsess kui geenipiirkondade lihtne interaktsioon histooni valkude molekulidega. 1960-1962 RB Khesin-Lurie laboris leiti, et faagi geene hakatakse lugema mitte üheaegselt: T2 faagi geene saab jagada varajasteks geenideks, mille funktsioneerimine toimus bakteriraku nakatumise esimestel minutitel. ja hilised geenid, mis hakkasid pärast varajaste geenide valmimist mRNA-d sünteesima.
1961. aastal pakkusid prantsuse biokeemikud F. Jacob ja J. Monod välja geenide aktiivsuse reguleerimise skeemi, millel oli erakordne roll raku regulatsioonimehhanismide mõistmisel üldiselt. Jacobi ja Monodi skeemi järgi sisaldab DNA lisaks struktuursetele (informatiivsetele) geenidele ka regulaatorgeene ja operaatorgeene. Geeniregulaator kodeerib spetsiifilise aine sünteesi – repressori, mida saab kinnitada nii indutseerija kui ka operaatorgeeni külge. Operaatorgeen on seotud struktuurigeenidega ja regulaatorgeen asub neist teatud kaugusel. Kui keskkonnas puudub indutseerija, näiteks laktoos, siis regulaatorgeeni poolt sünteesitav repressor seondub operaatorgeeniga ja seda blokeerides lülitab välja kogu operoni (struktuurigeenide plokk koos operaatoriga) töö. mis neid kontrollib). Ensüüm nendes tingimustes ei moodustu. Kui söötmesse ilmub indutseerija (laktoos), siis regulaatorgeeni produkt - repressor - seondub laktoosiga ja eemaldab ploki operaatorgeenist. Sel juhul saab võimalikuks ensüümi sünteesi kodeeriva struktuurgeeni töö ja ensüüm (laktoos) ilmub söötmesse.
Jacobi ja Monodi järgi on see reguleerimisskeem rakendatav kõikidele adaptiivsetele ensüümidele ja võib toimuda nii repressiooni ajal, kui ensüümi moodustumist pärsib reaktsiooniprodukti liig, kui ka induktsiooni ajal, kui substraadi lisamine põhjustab ensüümide sünteesi. Jacob ja Monod said 1965. aastal Nobeli preemia geenide aktiivsuse reguleerimise uuringute eest.
Esialgu tundus see skeem liiga kaugeleulatuv. Hiljem selgus aga, et geeniregulatsioon selle põhimõtte järgi ei toimu ainult bakterites, vaid ka teistes organismides.
Alates 1960. aastast on molekulaarbioloogias silmapaistva koha hõivanud eukarüootsete organismide genoomikorralduse ja kromatiini struktuuri uuringud (J. Bonner, R. Britten, W. Alfrey, P. Walker, Yu.S. Chentsov, IB Zbarsky jt ..) ja transkriptsiooni reguleerimine (A. Mirski, G. P. Georgiev, M. Bernstil, D. Goll, R. Tsanev, R. I. Salganik). Repressori olemus jäi pikka aega tundmatuks ja vastuoluliseks. 1968. aastal näitas M. Ptashne (USA), et valk on repressor. Ta eraldas selle J. Watsoni laboris ja leidis, et repressoril on tõepoolest afiinsus indutseerija (laktoosi) suhtes ja samal ajal "tunneb ära" lac-operoni geenioperaatori ja seondub sellega spetsiifiliselt.
Viimase 5-7 aasta jooksul on saadud andmeid teise geeniaktiivsuse kontrollraku – promootori – olemasolu kohta. Selgus, et operaatorikoha läheduses, mille külge kinnitub geeniregulaatoril sünteesitud toode, repressori proteiinaine, on veel üks koht, mis tuleks samuti omistada regulatsioonisüsteemi liikmetele. geenide aktiivsusest. Sellele kohale on kinnitatud RNA polümeraasi ensüümi valgumolekul. Promootorpiirkonnas peaks toimuma DNA ainulaadse nukleotiidjärjestuse ja RNA polümeraasi valgu spetsiifilise konfiguratsiooni vastastikune äratundmine. Promootoriga külgneva operoni antud geenijärjestusega geneetilise teabe lugemise protsessi rakendamine sõltub äratundmise efektiivsusest.
Lisaks Jacobi ja Monodi kirjeldatud skeemile on rakus ka teisi geeniregulatsiooni mehhanisme. F. Jacob ja S. Brenner (1963) leidsid, et bakteriaalse DNA replikatsiooni reguleerimist kontrollib teatud viisil rakumembraan. Jacobi (1954) katsed erinevate profaagide indutseerimisel näitasid veenvalt, et erinevate mutageensete tegurite mõjul algab lüsogeensete bakterite rakus profaagigeeni selektiivne replikatsioon ning peremeesgenoomi replikatsioon on blokeeritud. 1970. aastal teatas F. Bell, et väikesed DNA molekulid võivad siseneda tuumast tsütoplasmasse ja seal transkribeerida.
Seega saab geenide aktiivsust reguleerida replikatsiooni, transkriptsiooni ja translatsiooni tasemel.
Olulisi edusamme on tehtud mitte ainult ensüümide sünteesi reguleerimise, vaid ka nende aktiivsuse uurimisel. Ensüümide aktiivsuse reguleerimise nähtustele rakus osutasid juba 50ndatel aastatel A. Novik ja L. Szilard. G. Umbarger (1956) tegi kindlaks, et rakus on väga ratsionaalne viis ensüümi aktiivsuse pärssimiseks tagasisideahela lõpptoote poolt. Nagu on kindlaks teinud J. Monod, J. Changer, F. Jacob, A. Purdy ja teised teadlased (1956-1960), saab ensüümi aktiivsust reguleerida allosteerilise põhimõtte kohaselt. Ensüümil või ühel selle allüksusel on lisaks afiinsusele substraadi suhtes ka afiinsus ühe reaktsiooniahela produkti suhtes. Sellise signaalprodukti mõjul muudab ensüüm oma konformatsiooni nii, et see kaotab oma aktiivsuse. Selle tulemusena lülitatakse kogu ensümaatiliste reaktsioonide ahel kohe alguses välja. D. Weyman ja R. Woodward (1952; Nobeli preemia laureaat, 1965) tõid välja valgu konformatsiooniliste muutuste olulise rolli ensümaatilistes reaktsioonides ja teatud mõttes allosteerilise efekti olemasolu.
T. Osborne'i, G. Hofmeistri, A. Gürberi, F. Schulzi ja paljude teiste tööde tulemusena XIX sajandi lõpus. saadi palju loomseid ja taimseid valke kristalsel kujul. Umbes samal ajal kasutati mõnede valkude molekulmasside määramiseks erinevaid füüsikalisi meetodeid. Nii teatasid 1891. aastal A. Sabanejev ja N. Aleksandrov, et ovalbumiini molekulmass oli 14 000; 1905. aastal tegi E. Reid kindlaks, et hemoglobiini molekulmass on 48 000. Valkude polümeerse struktuuri avastasid 1871. aastal G. Glazivets ja D. Haberman. Idee üksikute aminohappejääkide peptiidsideme kohta valkudes esitas T. Curtius (1883). Tööd aminohapete keemilise kondenseerimise kohta (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano ja D. Truschiatti, 1900) ja heteropolüpeptiidide sünteesi kohta (E. Fischer, 1902-1907, Nobeli preemia, 1902) viis valkude keemilise struktuuri põhiprintsiipide väljatöötamiseni.
Esimese kristalse ensüümi (ureaasi) sai 1926. aastal J. Sumner (Nobeli preemia, 1946) ja 1930. aastal sai J. Northrop (Nobeli preemia, 1946) kristalse pepsiini. Pärast neid töid selgus, et ensüümid on valgulise iseloomuga. 1940. aastal eraldas M. Kunits kristalse RNAaasi. 1958. aastaks oli teada juba üle 100 kristallilise ensüümi ja enam kui 500 mittekristallilisel kujul eraldatud ensüümi. Üksikute valkude kõrgelt puhastatud preparaatide valmistamine aitas kaasa nende primaarstruktuuri ja makromolekulaarse korralduse dešifreerimisele.
Molekulaarbioloogia üldises arengus ja eelkõige inimese geneetikas omas suurt tähtsust L. Paulingu (1940) avastus rasket pärilikku haigust põdevate inimeste erütrotsüütidest eraldatud ebanormaalse hemoglobiini S-st – sirprakuline aneemia. Aastatel 1955-1957 V. Ingram kasutas F. Sengeri välja töötatud "sõrmejälgede" meetodit (täpid, mis tekivad üksikutest peptiididest kromatograafia käigus paberil), et analüüsida hemoglobiin S hüdrolüüsi saadusi leelise ja trüpsiiniga. 1961. aastal teatas Ingram, et hemoglobiin S erineb normaalsest hemoglobiinist vaid ühe aminohappejäägi olemuse poolest: normaalses hemoglobiinis on ahela seitsmendal positsioonil glutamiinhappe jääk, hemoglobiini S-s aga valiini jääk. See kinnitas täielikult (1949) Paulingi oletust, et sirprakuline aneemia on molekulaarse iseloomuga haigus. Pärilik muutus ainult ühes aminohappejäägis hemoglobiini makromolekuli mõlemas pooles viib selleni, et hemoglobiin kaotab madala hapnikukontsentratsiooni juures oma võime kergesti lahustuda ja hakkab kristalliseeruma, mis viib rakustruktuuri rikkumiseni. Need uuringud on selgelt näidanud, et valgu struktuur on rangelt määratletud aminohappejärjestus, mis on kodeeritud genoomis. Valgu primaarstruktuuri erakordset tähtsust makromolekuli ainulaadse bioloogiliselt aktiivse konformatsiooni kujunemisel tõestasid K. Anfinseni tööd (1951). Anfinsen näitas, et redutseerimise tulemusena kaotatud pankrease ribonukleaasi bioloogiliselt aktiivne makrostruktuur on eelnevalt määratud aminohappejärjestusega ja see võib spontaanselt uuesti ilmneda tsüsteiinijääkide SH-rühmade oksüdeerumisel koos disulfiidsete ristsidemete moodustumisega rangelt määratletud kohtades. ensüümi peptiidahelat.
Tänaseks on suure hulga ensüümide toimemehhanismi põhjalikult uuritud ja paljude valkude struktuur kindlaks tehtud.
1953. aastal kehtestas F. Senger insuliini aminohappejärjestuse. : See valk koosneb kahest polüpeptiidahelast, mis on seotud kahe disulfiidse ristsidemega. Üks ahelatest sisaldab ainult 21 aminohappejääki, teine aga 30 jääki. Sanger kulutas selle suhteliselt lihtsa valgu struktuuri dešifreerimiseks umbes 10 aastat. 1958. aastal pälvis ta selle silmapaistva uurimistöö eest Nobeli preemia. Pärast automaatse aminohapete analüsaatori loomist W. Steini ja S. Moore'i (1957) poolt kiirenes oluliselt valkude osalise hüdrolüüsi produktide tuvastamine. 1960. aastal teatasid sellest juba Stein ja Moore. et nad suutsid määrata ribonukleaasi järjestuse, mille peptiidahelat esindab 124 aminohappejääki. Samal aastal määrasid F. Anderer ja teised G. Schrammi laboris Tübingenis (Saksamaa) TMV valgu aminohappejärjestuse. Seejärel määrati aminohappejärjestus inimese hemoglobiini müoglobiini (A. Edmunson) ja α- ja β-ahelates (G. Braunitzer, E. Schroeder jt), kanamuna valgu lüsosüümis (J. Jollet, D. Keyfield). ). 1963. aastal kehtestasid F. Schorm ja B. Keil (Tšehhoslovakkia) kümotrüpsinogeeni molekulis aminohapete järjestuse. Samal aastal määrati trüpsinogeeni aminohappejärjestus (F. Schorm, D. Walsh). 1965. aastal kehtestas K. Takahashi ribonukleaasi T1 primaarstruktuuri. Seejärel määrati aminohappejärjestus veel mitmes valgus.
Nagu teate, on konkreetse struktuuri määratluse õigsuse lõplik tõend selle süntees. 1969. aastal sünteesis R. Merifield (USA) esimesena keemiliselt pankrease ribonukleaasi. Kasutades tahkefaasilisel kandjal välja töötatud sünteesimeetodit, lisas Merifield ahelasse ühe aminohappe teise järel vastavalt Steini ja Moore'i kirjeldatud järjestusele. Selle tulemusena sai ta valgu, mis oli oma omadustelt identne pankrease ribonukleaas A-ga. Ribonukleaasi V struktuuri avalikustamise eest pälvisid Stein, S. Moore ja K. Anfinsen 1972. aastal Nobeli preemia. See looduslik valgusüntees avab suurepärased väljavaated, mis viitab võimalusele luua mis tahes valke vastavalt eelnevalt kavandatud järjestusele.
W. Astbury (1933) röntgendifraktsiooniuuringutest järeldub, et valgumolekulide peptiidahelad on mingil rangelt määratletud viisil keerdunud või volditud. Sellest ajast peale on paljud autorid väljendanud erinevaid hüpoteese valguahelate voltimise meetodite kohta, kuid kuni 1951. aastani jäid kõik mudelid spekulatiivseteks konstruktsioonideks, mis ei vastanud eksperimentaalsetele andmetele. 1951. aastal avaldasid L. Pauling ja R. Corey rea suurepäraseid töid, milles formuleeriti lõpuks valkude sekundaarstruktuuri teooria – α-heeliksi teooria. Koos sellega sai teatavaks ka see, et valkudel on ka tertsiaarne struktuur: peptiidahela α-heeliksit saab teatud viisil voltida, moodustades üsna kompaktse struktuuri.
1957. aastal pakkusid J. Kendrew ja tema kaastöötajad esimest korda välja müoglobiini struktuuri kolmemõõtmelise mudeli. Seejärel viimistleti seda mudelit mitu aastat, kuni 1961. aastal ilmus viimane töö selle valgu ruumilise struktuuri iseloomustamisega. 1959. aastal tegi M. Perutz ja kolleegid kindlaks hemoglobiini kolmemõõtmelise struktuuri. Teadlased kulutasid sellele tööle üle 20 aasta (esimesed hemoglobiini röntgenpildid tegi Perutz 1937. aastal). Kuna hemoglobiini molekul koosneb neljast alaühikust, kirjeldas Perutz pärast selle organisatsiooni dešifreerimist esmalt valgu kvaternaarset struktuuri. Kendrew ja Perutz said 1962. aastal Nobeli preemia valkude kolmemõõtmelise struktuuri määramise töö eest.
Perutzi ENABLEDi hemoglobiini struktuuri ruumilise mudeli loomine. lähemale selle valgu toimimismehhanismi mõistmisele, mis, nagu teate, viib läbi hapniku ülekandmist loomarakkudesse. Veel 1937. aastal jõudis F. Gaurovitz järeldusele, et hemoglobiini vastasmõju hapniku ja õhuga peaks kaasnema valgu struktuuri muutumisega. 1960. aastatel avastasid Perutz ja tema kaastöötajad hemoglobiiniahelate märgatava nihke pärast oksüdatsiooni, mille põhjustas rauaaatomite nihe hapnikuga seondumise tagajärjel. Selle põhjal tekkisid ideed valgu makromolekulide "hingamise" kohta.
1960. aastal alustasid D. Phillips ja tema kaastöötajad lüsosüümmolekuli röntgenstruktuuriuuringuid. 1967. aastaks õnnestus neil enam-vähem täpselt kindlaks teha selle valgu struktuuri üksikasjad ja üksikute aatomite lokaliseerimine selle molekulis. Lisaks selgitas Phillips välja lüsosüümi substraadile (triatsetüülglükoosamiin) kinnitumise olemuse. See võimaldas uuesti luua selle ensüümi töömehhanismi. Seega võimaldasid teadmised primaarstruktuuri ja makromolekulaarse korralduse kohta mitte ainult kindlaks teha paljude ensüümide aktiivsete keskuste olemust, vaid ka täielikult paljastada nende makromolekulide toimimismehhanismi.
Elektronmikroskoopia meetodite kasutamine aitas välja selgitada selliste keeruliste valgumoodustiste nagu kollageen, fibrinogeeni filamendid, kontraktiilsed lihasfibrillid jne makromolekulaarse korralduse põhimõtted. 50. aastate lõpus pakuti välja lihaste kontraktiilse aparatuuri mudelid. V.A.Engel'gardti ja M.N.Lyubimova (1939) avastatud müosiini ATPaasi aktiivsus oli lihaskontraktsioonide mehhanismi mõistmisel erakordselt oluline. See tähendas, et lihaste kokkutõmbumise akt põhineb kontraktiilse valgu füüsikalis-keemiliste omaduste ja makromolekulaarse korralduse muutumisel adenosiintrifosforhappe mõjul (vt ka ptk 11).
Viroloogilised uuringud olid bioloogiliste struktuuride kokkupanemise põhimõtete mõistmiseks hädavajalikud (vt 25. peatükk).
Kaasaegse molekulaarbioloogia peamised edusammud on saavutatud peamiselt nukleiinhapete uurimise tulemusena. Sellegipoolest pole isegi selles valdkonnas kaugeltki kõik probleemid lahendatud. Eelkõige nõuab suuri jõupingutusi genoomi kogu nukleotiidjärjestuse dekodeerimine. See probleem on omakorda lahutamatult seotud DNA heterogeensuse probleemiga ja nõuab uute täiustatud meetodite väljatöötamist üksikute molekulide fraktsioneerimiseks ja eraldamiseks raku kogu geneetilisest materjalist.
Seni on jõupingutused keskendunud peamiselt valkude ja nukleiinhapete eraldi uurimisele. Rakus on need biopolümeerid üksteisega lahutamatult seotud ja toimivad peamiselt nukleoproteiinide kujul. Seetõttu on praegu eriti teravaks muutunud vajadus uurida valkude ja nukleiinhapete koostoimet. Rõhutatakse nukleiinhapete teatud piirkondade äratundmise probleemi valkude poolt. Nende biopolümeeride sellise interaktsiooni uurimiseks on juba kirjeldatud samme, ilma milleta on mõeldamatu kromosoomide, ribosoomide ja muude struktuuride struktuuri ja funktsioonide täielik mõistmine. Ilma selleta on samuti võimatu mõista geenide aktiivsuse regulatsiooni ja lõpuks dešifreerida valkude sünteesimehhanismide põhimõtteid. Pärast Jacobi ja Monodi tööd ilmusid mõned uued andmed membraanide reguleeriva rolli kohta tuumamaterjali sünteesil. See tekitab membraanide rolli sügavama uurimise probleemi DNA replikatsiooni reguleerimisel. Üldiselt on geenide aktiivsuse ja raku aktiivsuse reguleerimise probleem üldiselt muutunud kaasaegse molekulaarbioloogia üheks olulisemaks probleemiks.
Biofüüsika arenes välja tihedas seoses molekulaarbioloogia probleemidega. Huvi selle bioloogia valdkonna vastu ärgitas ühelt poolt vajadus põhjalikult uurida erinevat tüüpi kiirguse mõju organismile, teiselt poolt vajadus uurida kiirguse füüsikalisi ja füüsikalis-keemilisi aluseid. molekulaarsel tasandil toimuvad elunähtused.
Täpne teave molekulaarstruktuuride ja neis toimuvate protsesside kohta sai võimalikuks tänu uute peenfüüsikalis-keemiliste meetodite kasutamisele. Elektrokeemia saavutuste põhjal oli võimalik täiustada bioelektriliste potentsiaalide mõõtmise meetodit, kasutades ioonselektiivseid elektroode (G. Eisenman, B. P. Nikol'skii, Khuri, 1950-1960ndad). Üha enam levib infrapunaspektroskoopia (laserseadmete kasutamisega), mis võimaldab uurida valkude konformatsioonilisi muutusi (I. Plotnikov, 1940). Väärtuslikku teavet annavad ka elektronide paramagnetresonantsi meetod (EK Zavoisky, 1944) ja biokemoluminestsentsmeetod (BN Tarusov et al., 1960), mis võimaldavad eelkõige hinnata elektronide transporti oksüdatiivsete protsesside käigus.
50. aastateks on biofüüsika juba saavutamas tugevat positsiooni. Vaja on kvalifitseeritud spetsialistide väljaõpet. Kui 1911. aastal oli Euroopas ainult Pecsi ülikoolis Ungaris biofüüsika osakond, siis 1973. aastaks on sellised osakonnad olemas peaaegu kõigis suurtes ülikoolides.
1960. aastal asutati Rahvusvaheline Biofüüsikute Ühing. 1961. aasta augustis toimus Stockholmis esimene rahvusvaheline biofüüsika kongress. Teine kongress peeti 1965. aastal Pariisis, kolmas 1969. aastal Bostonis ja neljas 1972. aastal Moskvas.
Biofüüsikas on selgelt eristatud kaks erineva sisuga valdkonda – molekulaarbiofüüsika ja raku biofüüsika. See eristus saab ka organisatsioonilise väljenduse: nende kahe biofüüsika valdkonna eraldi osakonnad luuakse. Moskva ülikoolis loodi 1953. aastal esimene biofüüsika osakond bioloogia ja mullateaduse teaduskonnas, veidi hiljem loodi füüsikateaduskonna juurde biofüüsika osakond. Paljude teiste ülikoolide osakonnad korraldati samamoodi.
Viimastel aastatel on molekulaarbiofüüsika ja molekulaarbioloogia vaheline seos üha tugevnenud ning praegu on mõnikord raske kindlaks teha, kus nendevaheline liides asub. Üldises rünnakus päriliku teabe probleemile on biofüüsika ja molekulaarbioloogia selline koostöö vältimatu.
Uurimistöö põhisuunaks on nukleiinhapete – DNA ja RNA füüsika uurimine. Ülaltoodud meetodite kasutamine ja ennekõike röntgenstruktuurianalüüs aitasid kaasa nukleiinhapete molekulaarstruktuuri dešifreerimisele. Praegu on käimas intensiivsed uuringud nende hapete käitumise uurimiseks lahustes. Erilist tähelepanu pööratakse konformatsioonilistele üleminekutele "spiraalmähis", mida uuritakse viskoossuse muutuste, optiliste ja elektriliste näitajate järgi. Seoses mutageneesi mehhanismide uurimisega on arenemas uuringud, mille eesmärk on uurida ioniseeriva kiirguse mõju nukleiinhapete käitumisele lahustes, samuti kiirguse mõju viiruste ja faagide nukleiinhapetele. Ultraviolettkiirguse mõju allutati põhjalik analüüs, mille mõned spektripiirkonnad on teadaolevalt hästi neelduvad nukleiinhapete poolt. Nukleiinhapete ja valkude aktiivsete radikaalide tuvastamine elektronide paramagnetilise resonantsi meetodil võtab sellistes uuringutes suure osa. Selle meetodi kasutamine on seotud terve iseseisva suuna tekkimisega.
DNA ja RNA informatsiooni kodeerimise ja selle ülekandmise probleem valgusünteesi käigus on molekulaarbiofüüsikale pikka aega huvi pakkunud ning füüsikud on selles küsimuses korduvalt väljendanud teatud kaalutlusi (E. Schrödinger, G. Gamow). Geneetilise koodi dešifreerimine on põhjustanud arvukalt teoreetilisi ja eksperimentaalseid uuringuid DNA spiraali struktuuri, selle keermete libisemise ja keerdumise mehhanismi ning nende protsessidega seotud füüsiliste jõudude uurimise kohta.
Molekulaarbiofüüsika pakub molekulaarbioloogiale märkimisväärset abi valgusmolekulide struktuuri uurimisel röntgendifraktsioonianalüüsi abil, mida esmakordselt kasutas 1930. aastal J. Bernal. Füüsikaliste meetodite ja biokeemiliste (ensümaatiliste meetodite) kasutamise tulemusena selgus mitmete valkude molekulaarne konformatsioon ja aminohapete järjestus.
Kaasaegsed elektronmikroskoopilised uuringud, mis paljastasid keeruliste membraanisüsteemide olemasolu rakkudes ja nende organellides, stimuleerisid katseid mõista nende molekulaarstruktuuri (vt 10. ja 11. peatükk). Uuritakse membraanide in vivo keemilist koostist ja eelkõige nende lipiidide omadusi. Leiti, et viimased on võimelised peroksüdatsiooniks ja aheloksüdatsiooni mitteensümaatiliseks reaktsiooniks (Yu. A. Vladimirov ja F. F. Litvin, 1959; B. N. Tarusov et al., 1960; I. I. Ivanov, 1967), mis viib membraani funktsioonide rikkumiseni. . Membraanide koostise uurimiseks kasutati ka matemaatilise modelleerimise meetodeid (V. Ts. Presman, 1964 - 1968; M. M. Shemyakin, 1967; Yu. A. Ovchinnikov, 1972).
Märkimisväärne sündmus biofüüsika ajaloos oli 50ndatel selge arusaamine kujunemine bioloogiliste protsesside termodünaamikast, mille tulemusena tekkisid eeldused energia iseseisva genereerimise võimaluse kohta elusrakkudes, hoolimata teisest seadusest. termodünaamika on lõpuks kadunud. Selle seaduse toimimise mõistmine bioloogilistes süsteemides on seotud Belgia teadlase I. Prigogine'i (1945) * juurutamisega bioloogilisse termodünaamikasse avatud süsteemide kontseptsiooni, mis vahetavad energiat ja ainet väliskeskkonnaga. Prigogine näitas, et elusrakkudes tekib tööprotsesside käigus vastavalt termodünaamika teisele seadusele positiivne entroopia. Tema toodud võrrandid määrasid kindlaks tingimused, mille korral tekib nn statsionaarne olek (varem nimetati seda ka dünaamiliseks tasakaaluks), mille puhul toiduga rakkudesse sisenev vaba energia hulk (negentroopia) kompenseerib selle tarbimise ning positiivne entroopia on tuletatud. See avastus on toetanud üldist bioloogilist ideed lahutamatust seosest rakkude välis- ja sisekeskkonna vahel. See tähistas "elusate" süsteemide termodünaamika, sealhulgas modelleerimismeetodi tegeliku uurimise algust (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).
* (Avatud süsteemide üldteooria esitas esmakordselt L. Bertalanffy 1932. aastal.)
Biotermodünaamika põhiprintsiibi kohaselt on elu olemasolu vajalik tingimus selle biokeemiliste protsesside arengu statsionaarsus, mille läbiviimiseks on vaja koordineerida arvukate metaboolsete reaktsioonide kiirusi. Uue biofüüsikalise termodünaamika põhjal on tekkinud suund, mis eristab väliseid ja sisemisi tegureid, mis tagavad selle reaktsioonide koordineerimise ja muudavad selle stabiilseks. Viimase kahe aastakümne jooksul on ilmnenud suur roll inhibiitorite ja eriti antioksüdantide süsteemi stabiilse seisundi säilitamisel (BN Tarusov ja AI Zhuravlev, 1954, 1958). Leiti, et statsionaarse arengu usaldusväärsus on seotud keskkonnategurite (temperatuur) ja rakukeskkonna füüsikalis-keemiliste omadustega.
Kaasaegsed biotermodünaamika põhimõtted on võimaldanud anda kohanemismehhanismi füüsikalis-keemilise tõlgenduse. Meie andmetel saab kohaneda keskkonnatingimustega ainult siis, kui organism suudab neid muutes luua statsionaarsuse biokeemiliste reaktsioonide arengus (BN Tarusov, 1974). Tekkis küsimus uute meetodite väljatöötamise kohta, mis võimaldaksid hinnata statsionaarset seisundit in vivo ja ennustada selle võimalikke rikkumisi. Isereguleeruvate süsteemide küberneetiliste põhimõtete juurutamine biotermodünaamikasse ja bioloogilise kohanemisprotsesside uurimine tõotab suurt kasu. Selgus, et püsiseisundi stabiilsuse probleemi lahendamiseks on oluline arvestada nn häirivate teguritega, mille hulka kuuluvad eelkõige lipiidide oksüdatsiooni mitteensümaatilised reaktsioonid. Viimasel ajal on üha enam uuritud elusrakkude lipiidifaasides toimuvaid peroksüdatsiooniprotsesse ja membraanide regulatoorseid funktsioone häirivate aktiivsete radikaalsete saaduste kasvu. Nende protsesside infoallikaks on nii aktiivsete peroksiidradikaalide kui ka biolipiidide peroksiidühendite tuvastamine (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; EB Burlakova, 1967 jt). Radikaalide tuvastamiseks kasutatakse biokemoluminestsentsi, mis esineb elusrakkude lipiidides nende rekombinatsiooni käigus.
Statsionaarse oleku stabiilsuse füüsikalis-keemiliste ideede põhjal tekkisid biofüüsikalised ideed taimede kohanemise kohta keskkonnatingimuste muutustega kui inhibeerivate antioksüdantide süsteemide rikkumisega (B.N. Tarusov, Ya.E. Doskoch, B.M. Kitlaev, A.M. Agaverdiev, 1968–1972). See avas võimaluse hinnata selliseid omadusi nagu külmakindlus ja soolataluvus ning teha asjakohaseid prognoose põllumajandustaimede aretamisel.
50ndatel avastati ülinõrk luminestsents - mitmete bioloogiliste objektide biokemoluminestsents spektri nähtavas ja infrapunases osas (BN Tarusov, AI Zhuravlev, AI Polivoda). See sai võimalikuks tänu ülinõrkade valgusvoogude salvestamise meetodite väljatöötamisele fotokordisti torude abil (L.A. Kubetsky, 1934). Elusrakus toimuvate biokeemiliste reaktsioonide tulemusena võimaldab biokemoluminestsents hinnata olulisi oksüdatiivseid protsesse ensüümidevahelistes elektronide transpordiahelates. Biokemoluminestsentsi avastamine ja uurimine on suure teoreetilise ja praktilise tähtsusega. Seega märgivad BN Tarusov ja Yu. B. Kudryashov küllastumata rasvhapete oksüdatsiooniproduktide olulist rolli kantserogeneesi ajal ioniseeriva kiirguse mõjul tekkivate patoloogiliste seisundite tekkemehhanismis ja muudes normaalsete rakufunktsioonide häiretes.
1950. aastatel tekkis seoses tuumafüüsika kiire arenguga biofüüsikast radiobioloogia, mis uurib ioniseeriva kiirguse bioloogilist mõju. Kunstlike radioaktiivsete isotoopide tootmine, termotuumarelvade, aatomireaktorite loomine ja aatomienergia muude praktiliste kasutusviiside arendamine on seadnud kiireloomulise probleemina organismide kaitsmise ioniseeriva kiirguse kahjulike mõjude eest ning teoreetilise kiirguse väljatöötamise. kiiritushaiguse ennetamise ja ravi alused. Selleks oli vaja ennekõike välja selgitada, millised raku komponendid ja metaboolsed sidemed on kõige haavatavamad.
Biofüüsika ja radiobioloogia uurimise objektiks oli elussubstraatides kiirgusenergia mõjul toimuvate esmaste keemiliste reaktsioonide olemuse väljaselgitamine. Siin oli oluline mitte ainult mõista selle nähtuse mehhanisme, vaid ka mõjutada füüsikalise energia keemiliseks energiaks vahetamise protsessi, vähendada selle "kasuliku" toime koefitsienti. Sellesuunaline töö pani aluse N. N. Semenovi (1933) koolkonna õppimisele NSV Liidus ja D. Hinshelwoodi (1935) Inglismaal.
Radiobioloogilistes uuringutes on olulise koha hõivanud erinevate organismide kiirguskindluse astme uurimine. Leiti, et suurenenud radioresistentsus (näiteks kõrbete närilistel) on tingitud rakumembraanide lipiidide kõrgest antioksüdantsest aktiivsusest (M. Chang et al., 1964; NK Ogryzov et al., 1969). Selgus, et nende süsteemide antioksüdatiivsete omaduste kujunemisel mängivad olulist rolli tokoferoolid, K-vitamiin ja tioühendid (II Ivanov et al., 1972). Viimastel aastatel on suurt tähelepanu pälvinud ka mutageneesi mehhanismide uuringud. Selleks uuritakse ioniseeriva kiirguse mõju nukleiinhapete ja valkude käitumisele in vitro, aga ka viirustes ja faagides (A. Gustafson, 1945-1950).
Võitlus keemilise kaitse efektiivsuse edasise tõstmise nimel, tõhusamate inhibiitorite otsimine ja pärssimise põhimõtted jäävad biofüüsika põhiülesanneteks selles suunas.
Biopolümeeride ergastatud olekute uurimine, mis määravad nende kõrge keemilise aktiivsuse, on edenenud. Kõige edukam oli fotobioloogiliste protsesside - fotosünteesi ja nägemise - algfaasis tekkivate ergastatud olekute uurimine.
Seega on oluline panus taimede pigmendisüsteemide molekulide esmase aktiveerimise mõistmisse. On kindlaks tehtud ergastatud olekute energia kadudeta ülekandmise (migratsiooni) väärtus aktiveeritud pigmentidelt teistele substraatidele. Nende ideede väljatöötamisel mängisid olulist rolli A. N. Terenini (1947 ja hiljem) teoreetilised tööd. AA Krasnovsky (1949) avastas ja uuris klorofülli ja selle analoogide pöörduva fotokeemilise redutseerimise reaktsiooni. Praegu on levinud arvamus, et lähitulevikus on võimalik fotosünteesi taastoota tehistingimustes (vt ka ptk 5).
Biofüüsikud jätkavad tööd, et paljastada lihaste kokkutõmbumise olemus ning närvide ergutamise ja juhtivuse mehhanismid (vt 11. peatükk). Aktuaalset tähtsust on omandanud ka ergastatud seisundist normaalolekusse ülemineku mehhanismide uuringud. Ergastatud olekut peetakse nüüd autokatalüütilise reaktsiooni tulemuseks ja inhibeerimine on inhibeeriva antioksüdantse aktiivsuse järsu mobiliseerimise tagajärg, mis on tingitud molekulaarsetest ümberkorraldustest sellistes ühendites nagu tokoferool (I.I. Ivanov, O.R. Kols, 1966; O.R. Kols, 1970).
Biofüüsika kõige olulisem üldprobleem jääb elusaine kvalitatiivsete füüsikaliste ja keemiliste omaduste tundmine. Selliseid omadusi nagu elusate biopolümeeride võime kaaliumi selektiivselt siduda või elektrivoolu polariseerida ei saa säilitada isegi kõige hoolikama kehast eemaldamise korral. Seetõttu jätkab rakkude biofüüsika intensiivselt elusaine in vivo uurimise kriteeriumide ja meetodite väljatöötamist.
Vaatamata molekulaarbioloogia noorusele on selles valdkonnas saavutatud edu tõeliselt vapustav. Suhteliselt lühikese aja jooksul on paika pandud geeni olemus ning selle organiseerimise, paljunemise ja toimimise aluspõhimõtted. Pealegi ei ole teostatud mitte ainult geenide in vitro reprodutseerimist, vaid esimest korda on lõppenud ka geeni enda täielik süntees. Geneetiline kood on täielikult dešifreeritud ja kõige olulisem bioloogiline probleem valkude biosünteesi spetsiifilisusest on lahendatud. Peamised valgu moodustumise teed ja mehhanismid rakus on kindlaks tehtud ja uuritud. Paljude transpordi-RNA-de – spetsiifiliste adaptermolekulide, mis tõlgivad nukleiinmaatriksite keele sünteesitud valgu aminohappejärjestuse keelde – esmane struktuur on täielikult kindlaks määratud. Paljude valkude aminohappejärjestus on täielikult dešifreeritud ja osade ruumiline struktuur kindlaks tehtud. See võimaldas selgitada ensüümi molekulide toimimise põhimõtet ja üksikasju. Ühe ensüümi, ribonukleaasi, keemiline süntees on läbi viidud. On välja töötatud erinevate subtsellulaarsete osakeste, paljude viiruste ja faagide organiseerimise põhiprintsiibid ning lahti harutatud nende rakus toimuva biogeneesi peamised teed. Avaldatud on lähenemisviise geenide aktiivsuse reguleerimise viiside mõistmiseks ja elutähtsa aktiivsuse regulatsioonimehhanismide selgitamiseks. Juba nende avastuste lihtne loetelu näitab, et XX sajandi teisel poolel. iseloomustasid tohutud edusammud bioloogias, mis on eelkõige tingitud bioloogiliselt oluliste makromolekulide – nukleiinhapete ja valkude – struktuuri ja funktsioonide süvitsi uurimisest.
Molekulaarbioloogia saavutusi kasutatakse juba praktikas ja need annavad käegakatsutavaid tulemusi meditsiinis, põllumajanduses ja mõnes tööstuses. Pole kahtlust, et selle teaduse mõju suureneb iga päevaga. Peamiseks tulemuseks tuleks aga siiski pidada seda, et molekulaarbioloogia õnnestumiste mõjul on tugevnenud kindlustunne piiramatute võimaluste olemasolu teel elu kõige intiimsemate saladuste paljastamiseni.
Ilmselt avastatakse tulevikus uusi viise aine liikumise bioloogilise vormi uurimiseks – bioloogia liigub molekulaarselt tasandilt aatomitasandile. Nüüd pole aga ehk ainsatki teadlast, kes suudaks reaalselt ennustada molekulaarbioloogia arengut isegi järgmiseks 20 aastaks.
