Kodu, disain, renoveerimine, sisustus. Õu ja aed. Oma kätega

PCR diagnostika - mis see on? Polümeraasi ahelreaktsiooni olemus seisneb selles, et bioloogilise materjali uurimiseks kasutatakse spetsiaalset tüüpi markereid, mis analüüsivad kiiresti nakkusetekitajate DNA-d. Günekoloogias on naistele erinevaid PCR-analüüside meetodeid, olenevalt uuritavast materjalist (veri, uriin, määrded jne). Pärast andmete töötlemist tehakse kindlaks patogeeni tüüp (see on niinimetatud "PCR kvalitatiivne analüüs") ja/või nende kontsentratsioon - seda tüüpi uuringut nimetatakse "PCR kvantitatiivseks analüüsiks".

Testide tegemine PCR-meetodil võimaldab teil kiiresti kontrollida nakkuspatoloogia patogeene, kui seda pole võimalik teha teiste testidega (immunoloogilised, bakterioloogilised, mikroskoopiad). Kaasaegses laboridiagnostikas on PCR kõige tõhusam ja parim viis mikroobide ja viiruste DNA tuvastamiseks. Test võimaldab günekoloogil ja teistel kliiniku arstidel mitte ainult kindlaks teha naiste ja meeste haiguse põhjuseid, vaid ka jälgida protsessi kulgu ja õigesti hinnata ravi tulemust.

PCR diagnostika hinnad

MIDA PCR NÄITAB

Kvalitatiivne PCR analüüs annab märku nakkustekitaja otsesest esinemisest inimese või looma kehas. Võite võtta peaaegu igast asukohast (suguelundite, ureetra, orofarünksi jne) määrdumise või PCR-vereanalüüsi. Günekoloogias määrdumise või kraapimise abil kontrollitakse klamüüdia, uurea ja mükoplasma, herpesviiruse, HPV ja teiste mikroobide suhtes. DNA-analüüsi tulemus antakse patsiendile labori järeldusega "tuvastatud" või "ei tuvastatud". Vereanalüüsi puhul võimaldab see väga varajases staadiumis tuvastada HIV, hepatiidi, herpese, tsütomegaloviiruse jt mikroorganismid ning mõnel juhul määrata nende genotüübi ja näidata kogust.

Kvantitatiivsed PCR analüüsid.
Uuring võimaldab mitte ainult kiiresti tuvastada soovitud geneetilist materjali, vaid ka näidata nende DNA kontsentratsiooni (kvantitatiivne PCR meetod). Patogeenide tüübi ja arvu määramine on oluline ravi otsustamisel, eriti kui tuvastatakse näiteks mükoplasma (DNA kvantifitseerimine), ureaplasma tüpiseerimine (DNA kvantifitseerimine) või, mis kõige olulisem, saab teha genotüpiseerimist ja viiruskoormuse kvantifitseerimist. HPV infektsioon.

PCR TULEMUSED

Kõigest öeldust on selge, mis on PCR-analüüs ja millised on selle testi eelised günekoloogias. Selle diagnoosi teine ​​oluline nüanss on see, et tulemuse dešifreerimine on mitteprofessionaalile kättesaadav ja mugav. Arvestades seda, kui palju PCR-analüüse kliinikus tehakse, samuti aega, mis kulub raporti valmimiseks (labor annab info tavaliselt 1-2 päevaga), saab sellest diagnostikameetodist parim valik kõigi suuremate günekoloogiliste ja muud infektsioonid.

Kasutades naiste ja meeste määrde DNA testimise kvalitatiivset meetodit, teeb labor kahte tüüpi järeldusi:

1. "PCR negatiivne" - uuritavas materjalis patogeeni ei tuvastatud ja
2. “PCR positiivne” – testis leiti mikroobi või viiruse RNA või DNA.

PCR günekoloogias

Näidustused nende testide tegemiseks naistel on järgmised:

• Võimaliku STI-nakkuse kahtlus;
• Anonüümne küsitlus;
• Erituse esinemine suguelunditest, sügelus;
• Valu alakõhus;
• Ebamugavustunne urineerimisel;
• Valu seksuaalvahekorra ajal;
• Kõrgenenud leukotsüüdid taimestiku määrdeanalüüsis;
• Erosiooni olemasolu emakakaelal;
• Raseduse planeerimine;
• Probleemid eostamise ja lapse kandmisega;
• Ettevalmistus günekoloogilisteks operatsioonideks, IVF;
• Ennetuslikel eesmärkidel.

Kus on Moskvas parim PCR-testi tegemiseks?
Seda tüüpi günekoloogia diagnostika kuulub kaasaegsete ja kõrgtehnoloogiliste meetodite hulka. Infektsioonitestid PCR-meetodil tuleks teha kliinikus, kus on olemas kõik vajalik täielike tulemuste saamiseks. Meie meditsiinikeskuses võtavad proovid kvalifitseeritud, kogemustega günekoloogid (mitte ravikabineti keskmine personal), kasutatakse ühekordseid instrumente ja spetsiaalseid laborimaterjale ning patsientidelt saadud proovid saadetakse igapäevaselt tööle. See võimaldab teil mitte ainult kiiresti saada PCR-i tulemusi, vaid ka tagada nende usaldusväärsuse. Soovi korral täida küsitluse anonüümsus.

Kui palju PCR maksab?
Seda teenust pakuvad paljud pealinna meditsiiniasutused. Kulusid mõjutavad paljud tegurid, alates asukohast kuni sisemise hinnapoliitikani. Siiski on objektiivsed tegurid, mis määravad keskmise miinimumarvu, millest allapoole ei ole võimalik kvaliteetset ja usaldusväärset teenust nimetatud tegurite tõttu pakkuda. Moskva kliinikute PCR-diagnostika keskmine hind mõne infektsiooni korral on järgmine:

• kvalitatiivne PCR-määrimise analüüs - 400 - 500 rubla;
• PCR-määrde kvantitatiivne analüüs - alates 600 rubla (1 ühik);
• Kraapide RNA diagnostika - alates 1000 rubla (1 ühik);
• Kvalitatiivne PCR vereanalüüs (näiteks herpese, HPV, Epstein-Barri viiruse, tsütomegaloviiruse puhul) - 450-550 rubla, kvantitatiivne - alates 2000 rubla;
• Kvalitatiivne HIV DNA (HIV esinemise ümberlükkamine/kinnitus prekliinilisel perioodil) - alates 2000 rubla, kvantitatiivne RNA - alates 7000 rubla, resistentsus - alates 14 000 rubla.

Ettevalmistus PCR jaoks

Õigete ja usaldusväärsete uurimistulemuste saamiseks peaksid tüdrukud ja naised järgima teatud reegleid, enne kui lähevad nakkustestile:

1-2 päeva enne testimiskülastust kliinikusse hoiduma seksuaalvahekorrast;
- hoiduda urineerimisest 1,5-2 tundi enne määrdumist;
- teostage välissuguelundite hügieeni puhta veega, ilma pesuvahenditeta, vältige pesemist;
- välistada vaginaalsete tablettide, suposiitide kasutamine;
- ärge võtke menstruatsiooni ajal PCR-analüüse;
- kui olete neitsi, hoiatage sellest günekoloogi enne läbivaatust.

Kuidas teha PCR-teste

PCR-testi tegemine meie kliinikus, sealhulgas anonüümselt, on üsna lihtne. Järgmisena selgitame, kuidas PCR-i naistelt ja meestelt võetakse ning kust, millistest kohtadest on see uuring kõige informatiivsem.

Naise puhul võtab analüüsi günekoloog. Tavaliselt juhtub see esmasel kohtumisel arstiga või ilma eelneva konsulteerimiseta lihtsalt infektsioonitesti saamiseks. Kõik on vastavalt teie soovidele. Ütlete välja oma soovid, milliste infektsioonide suhtes soovite end testida ja peale seda algab materjali kogumise protseduur. Patsient riietub vööst allapoole ja istub toolile. Pärast häbememokkade laiali levikut sisestab arst tuppe sobiva suurusega günekoloogilise täppi. Günekoloogid võtavad naistelt PCR-i, tavaliselt emakakaelast, aga ka ureetrast. Viimasel juhul tehakse enne sondi sisestamist tuppe sisestatud sõrmega ureetra lühike massaaž. Kui PCR-testi teevad teismelised tüdrukud või neitsitüdrukud, siis peeglit ei kasutata ja eritusproovid võetakse neitsinaha või tupe vestibüüli avause kaudu. Saadud materjal asetatakse spetsiaalse söötmega suletud torusse ja saadetakse laborisse.

Selle analüüsi võtmine meestelt ei tekita erilisi raskusi. Sond sisestatakse 3-4 cm sügavusele kusiti ja keeratakse mitu korda päri- ja vastupäeva. Materjal pannakse ka katseklaasi järgnevaks diagnostikaks.

Toona jäi see idee aga kasutamata. Polümeraasi ahelreaktsiooni avastas 1983. aastal uuesti Kary Mullis. Tema eesmärk oli luua meetod, mis võimaldaks DNA-d amplifitseerida algse DNA molekuli mitme järjestikuse dubleerimise kaudu, kasutades ensüümi DNA polümeraasi. 7 aastat pärast selle idee avaldamist, 1993. aastal, sai Mullis selle eest Nobeli preemia.

Meetodi kasutamise alguses, pärast iga kuumutamis-jahutustsüklit, tuli reaktsioonisegule lisada DNA polümeraas, kuna see inaktiveeriti kiiresti kõrgel temperatuuril, mis oli vajalik DNA heeliksi ahelate eraldamiseks. Protseduur oli väga ebaefektiivne ja nõudis palju aega ja ensüümi. 1986. aastal parandati seda oluliselt. On tehtud ettepanek kasutada termofiilsete bakterite DNA polümeraase. Need ensüümid osutusid termostabiilseteks ja suutsid vastu pidada paljudele reaktsioonitsüklitele. Nende kasutamine võimaldas PCR-i lihtsustada ja automatiseerida. Bakteritest eraldati üks esimesi termostabiilseid DNA polümeraase Thermus aquaticus ja nimega Taq- polümeraas. Selle polümeraasi puuduseks on see, et eksliku nukleotiidi sisestamise tõenäosus on üsna suur, kuna sellel ensüümil puuduvad veaparandusmehhanismid (3"→5" eksonukleaasi aktiivsus). Polümeraasid Pfu Ja Pwo, mis on isoleeritud arheadest, omavad sellist mehhanismi, et nende kasutamine vähendab oluliselt mutatsioonide arvu DNA-s, kuid nende töö kiirus (protsessivõime) on väiksem kui nendel; Taq. Tänapäeval kasutatakse segusid Taq Ja Pfu saavutada nii kõrge polümerisatsioonikiirus kui ka kõrge kopeerimistäpsus.

Meetodi leiutamise ajal töötas Mullis ettevõttes Cetus, mis patenteeris PCR-meetodi. 1992. aastal müüs Cetus meetodi õigused ja kasutamise patendi Taq- polümeraasiettevõte Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) 300 miljoni dollari eest. Siiski selgus, et Taq-polümeraasi iseloomustas 1980. aastal vene biokeemik Aleksei Kaledin ja Promega püüdis sundida Roche'i selle ensüümi ainuõigusi loobuma. USA patent PCR-meetodile lõppes 2005. aasta märtsis.

PCR läbiviimine

Meetod põhineb teatud DNA lõigu korduval selektiivsel kopeerimisel ensüümide abil kunstlikes tingimustes ( in vitro). Sel juhul kopeeritakse ainult määratud tingimustele vastav jaotis ja ainult siis, kui see on uuritavas valimis. Erinevalt DNA amplifikatsioonist elusorganismides (replikatsioonist) amplifitseeritakse PCR abil suhteliselt lühikesed DNA lõigud. Tavalises PCR protsessis ei ületa kopeeritud DNA lõikude pikkus 3000 aluspaari (3 kbp). Kasutades erinevate polümeraaside segu, kasutades lisandeid ja teatud tingimustel, võib PCR fragmendi pikkus ulatuda 20-40 tuhande nukleotiidipaarini. See on endiselt oluliselt väiksem kui eukarüootse raku kromosomaalse DNA pikkus. Näiteks koosneb inimese genoom ligikaudu 3 miljardist aluspaarist.

Reaktsiooni komponendid

PCR-i läbiviimiseks kõige lihtsamal juhul on vaja järgmisi komponente:

• DNA maatriks, mis sisaldab amplifitseerimist vajavat DNA osa.
• Kaks praimerit, mis on komplementaarne soovitud DNA fragmendi erinevate ahelate vastasotstega.
• Termiliselt stabiilne DNA polümeraas- ensüüm, mis katalüüsib DNA polümerisatsioonireaktsiooni. PCR-is kasutatav polümeraas peab jääma kõrgel temperatuuril aktiivseks pikka aega, seetõttu kasutatakse termofiilidest eraldatud ensüüme - Thermus aquaticus(Taq polümeraas), Pyrococcus furiosus(Pfu polümeraas), Pyrococcus woesei(Pwo polümeraas) ja teised.
• Deoksünukleosiidtrifosfaadid(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Polümeraasi tööks vajalikud Mg 2+ ioonid.
• Puhverlahus, tagades vajalikud reaktsioonitingimused - pH, lahuse ioontugevus. Sisaldab sooli, veise seerumi albumiini.

Reaktsioonisegu aurustumise vältimiseks lisage katseklaasi kõrge keemistemperatuuriga õli, näiteks vaseliin. Kui kasutate soojendusega kaanega termotsükleri, pole see vajalik.

Pürofosfataasi lisamine võib suurendada PCR reaktsiooni saagist. See ensüüm katalüüsib kasvavale DNA ahelale nukleotiidtrifosfaatide lisamise kõrvalsaaduse pürofosfaadi hüdrolüüsi ortofosfaadiks. Pürofosfaat võib inhibeerida PCR reaktsiooni.

Praimerid

PCR spetsiifilisus põhineb komplementaarsete komplekside moodustumisel matriitsi ja praimerite vahel, lühikesed sünteetilised oligonukleotiidid pikkusega 18-30 alust. Iga praimer on komplementaarne kaheahelalise matriitsi ühe ahelaga ja piirab amplifitseeritud piirkonna algust ja lõppu.

Pärast matriitsi hübridiseerimist praimeriga (anniilimine) toimib viimane DNA polümeraasi praimerina komplementaarse matriitsi ahela sünteesi ajal (vt.).

Praimerite kõige olulisem omadus on praimer-maatriksi kompleksi sulamistemperatuur (Tm). T m on temperatuur, mille juures pooled DNA matriitsidest moodustavad kompleksi oligonukleotiidpraimeriga. Sulamistemperatuuri saab ligikaudselt määrata valemiga, kus n X on nukleotiidide X arv praimeris. Kui praimeri pikkus ja nukleotiidide koostis või anniilimistemperatuur on valesti valitud, on võimalik osaliselt komplementaarsete komplekside moodustumine teiste matriitsi DNA piirkondadega, mis võib viia mittespetsiifiliste produktide ilmnemiseni. Sulamistemperatuuri ülempiiri piirab polümeraasi optimaalne toimetemperatuur, mille aktiivsus langeb temperatuuril üle 80 °C.

Kruntvärvide valimisel on soovitatav järgida järgmisi kriteeriume:

Võimendi

Riis. 1: Cycler PCR jaoks

PCR viiakse läbi termotsükleris – seadmes, mis tagab katseklaaside perioodilise jahutamise ja kuumutamise, tavaliselt täpsusega vähemalt 0,1 °C. Kaasaegsed tsikliseadmed võimaldavad seadistada keerulisi programme, sealhulgas "kuumkäivituse", Touchdown-PCR-i (vt allpool) ja amplifitseeritud molekulide hilisemat säilitamist temperatuuril 4 °C. Reaalajas PCR jaoks toodetakse fluorestsentsdetektoriga varustatud seadmeid. Samuti on olemas automaatse kaanega seadmeid ja lahtrit mikroplaatide jaoks, mis võimaldab need integreerida automatiseeritud süsteemidesse.

Reaktsiooni edenemine

Foto geelist, mis sisaldab marker-DNA-d (1) ja PCR reaktsiooniprodukte (2, 3). Numbrid näitavad DNA fragmentide pikkust nukleotiidide paarides

Tavaliselt hõlmab PCR 20-35 tsüklit, millest igaüks koosneb kolmest etapist (joonis 2).

Denatureerimine

Kaheahelalist DNA matriitsi kuumutatakse temperatuuril 94-96 °C (või temperatuurini 98 °C, kui kasutatakse eriti termostabiilset polümeraasi) 0,5-2 minutiks DNA ahelate eraldamiseks. Seda etappi nimetatakse denatureerimine, kuna vesiniksidemed kahe DNA ahela vahel hävivad. Mõnikord enne esimest tsüklit (enne polümeraasi lisamist) reaktsioonisegu eelkuumutatakse 2-5 minutit. matriitsi ja praimerite täielikuks denatureerimiseks. Seda tehnikat nimetatakse kuum start, võimaldab see vähendada mittespetsiifiliste reaktsiooniproduktide hulka.

Lõõmutamine

Kui kiud on eraldunud, alandatakse temperatuuri, et praimerid saaksid seonduda üheahelalise malliga. Seda etappi nimetatakse lõõmutamine. Lõõmutamistemperatuur sõltub praimerite koostisest ja valitakse tavaliselt 4-5°C nende sulamistemperatuurist madalamal. Lava aeg - 0,5-2 minutit. Vale anniilimistemperatuuri valik põhjustab kas praimerite kehva seondumise matriitsiga (liiga kõrgel temperatuuril) või vales kohas seondumise ja mittespetsiifiliste saaduste ilmumise (liiga madalal temperatuuril).

Pikendamine

PCR tüübid

• Pesastatud PCR-i (Nested PCR) kasutatakse reaktsiooni kõrvalproduktide arvu vähendamiseks. Kasutatakse kahte paari praimereid ja viiakse läbi kaks järjestikust reaktsiooni. Teine praimerite paar võimendab DNA piirkonda esimese reaktsiooni produktis.
• "Ümberpööratud" PCR (inverse PCR) - kasutatakse juhul, kui soovitud järjestuses on teada ainult väike piirkond. See meetod on eriti kasulik naaberjärjestuste määramisel pärast DNA sisestamist genoomi. Pööratud PCR-i läbiviimiseks tehakse restriktsiooniensüümidega DNA lõikamine, millele järgneb fragmentide ühendamine (ligeerimine). Selle tulemusena satuvad teadaolevad fragmendid tundmatu piirkonna mõlemasse otsa, misjärel saab tavapäraselt läbi viia PCR.
• Pöördtranskriptsiooni PCR-i (RT-PCR) kasutatakse teadaoleva järjestuse amplifitseerimiseks, isoleerimiseks või identifitseerimiseks RNA raamatukogust. Enne tavapärast PCR-i sünteesitakse üheahelaline DNA molekul mRNA matriitsil, kasutades pöördfaasi ja saadakse üheahelaline cDNA, mida kasutatakse PCR matriitsina. See meetod määrab sageli, kus ja millal need geenid ekspresseeritakse.
• Asümmeetriline PCR Asümmeetriline PCR) – viiakse läbi, kui on vaja amplifitseerida valdavalt ühte algse DNA ahelatest. Kasutatakse mõnes sekveneerimis- ja hübridisatsioonianalüüsi tehnikas. PCR viiakse läbi nagu tavaliselt, välja arvatud see, et ühte praimerit võetakse suures liias.
• Kvantitatiivset PCR-i (Q-PCR) kasutatakse spetsiifilise DNA, cDNA või RNA koguse kiireks mõõtmiseks proovis.
• Kvantitatiivne reaalajas PCR – see meetod kasutab fluorestseeruvalt märgistatud reaktiive, et mõõta täpselt reaktsiooniprodukti kogust selle akumuleerumisel.
• Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - seda meetodit kasutades väheneb praimerite mittespetsiifilise seondumise mõju toote moodustumisele. Esimesed tsüklid viiakse läbi lõõmutamistemperatuurist kõrgemal temperatuuril, seejärel alandatakse temperatuuri iga paari tsükli järel. Teatud temperatuuril läbib süsteem DNA jaoks optimaalse praimeri spetsiifilisuse riba.
• Molekulaarse koloonia meetod (PCR geelis, inglise keel. Polony - PCR koloonia) - akrüülamiidgeel polümeriseeritakse kõigi PCR komponentidega pinnal ja viiakse läbi PCR. Analüüsitud DNA-d sisaldavates punktides toimub amplifikatsioon koos molekulaarsete kolooniate moodustumisega.
• PCR cDNA otste kiire amplifikatsiooniga cDNA otste kiire amplifikatsioon, RACE-PCR )
• Pika fragmendi PCR Pikamaa PCR) - PCR modifikatsioon DNA laiendatud lõikude (10 tuhat alust või rohkem) amplifitseerimiseks. Kasutatakse kahte polümeraasi, millest üks on kõrge protsessiivsusega Taq polümeraas (see tähendab, et see on võimeline ühe käiguga sünteesima pikka DNA ahelat) ja teine ​​on 3"-5" endonukleaasi aktiivsusega DNA polümeraas. Teine polümeraas on vajalik esimese poolt tekitatud vigade parandamiseks.
• RAPD PCR Polümorfse DNA PCR juhuslik amplifikatsioon , PCR polümorfse DNA juhusliku amplifikatsiooniga – kasutatakse siis, kui on vaja eristada geenijärjestuselt lähedasi organisme, näiteks erinevaid kultuurtaimede sorte, koeratõuge või lähedalt seotud mikroorganisme. Selle meetodi puhul kasutatakse tavaliselt ühte väikest praimerit (20–25 aluspaari). See praimer on osaliselt komplementaarne uuritavate organismide DNA juhuslike lõikudega. Tingimuste (praimeri pikkus, koostis, temperatuur jne) valimisel on võimalik saavutada kahe organismi puhul rahuldav erinevus PCR mustris.

Kui malli nukleotiidjärjestus on osaliselt teada või üldse teadmata, võite kasutada degenereerunud praimerid, mille jada sisaldab degenereerunud positsioone, milles võivad paikneda kõik alused. Näiteks võib praimeri järjestus olla: ...ATH..., kus H on A, T või C.

PCR rakendamine

PCR-i kasutatakse paljudes valdkondades testimiseks ja teaduslikeks katseteks.

Kohtuekspertiisi

PCR-i kasutatakse niinimetatud "geneetiliste sõrmejälgede" võrdlemiseks. Vaja on kuriteopaiga geneetilise materjali proovi – veri, sülg, sperma, juuksed jne. Seda võrreldakse kahtlustatava geneetilise materjaliga. Piisab väga väikesest kogusest DNA-st, teoreetiliselt ühest koopiast. DNA jagatakse fragmentideks ja amplifitseeritakse seejärel PCR abil. Fragmendid eraldatakse DNA elektroforeesi abil. Saadud pilti DNA ribade paigutusest nimetatakse geneetiline sõrmejälg(inglise) geneetiline sõrmejälg).

Isaduse tuvastamine

Riis. 3: PCR-ga amplifitseeritud DNA fragmentide elektroforeesi tulemused. (1) Isa. (2) Laps. (3) Ema. Laps päris mõlema vanema geneetilise jälje mõned tunnused, mille tulemuseks oli uus ainulaadne jäljend.

Kuigi geneetilised sõrmejäljed on ainulaadsed (v.a identsete kaksikute puhul), saab perekondlikke suhteid luua siiski mitme sõrmejälje tegemisega (joonis 3). Sama meetodit saab rakendada, veidi muudetud kujul, et teha kindlaks organismide evolutsiooniline seos.

Meditsiiniline diagnostika

PCR võimaldab oluliselt kiirendada ja hõlbustada pärilike ja viirushaiguste diagnoosimist. Huvipakkuvat geeni amplifitseeritakse PCR abil, kasutades sobivaid praimereid, ja seejärel sekveneeritakse mutatsioonide tuvastamiseks. Viirusnakkusi saab avastada kohe pärast nakatumist, nädalaid või kuid enne sümptomite ilmnemist.

Personaliseeritud meditsiin

On teada, et enamik ravimeid ei mõju kõigile patsientidele, kellele need on mõeldud, vaid ainult 30-70% nende arvust. Lisaks osutuvad paljud ravimid mõne patsiendi jaoks mürgiseks või allergeenseks. Selle põhjused on osaliselt tingitud individuaalsetest erinevustest ravimite ja nende derivaatide tundlikkuses ja metabolismis. Need erinevused määratakse geneetilisel tasandil. Näiteks võib ühel patsiendil teatud tsütokroom (maksavalk, mis vastutab võõrainete metabolismi eest) olla aktiivsem, teisel - vähem. Selleks, et teha kindlaks, millist tüüpi tsütokroom konkreetsel patsiendil on, on soovitatav enne ravimi kasutamist läbi viia PCR-analüüs. Seda analüüsi nimetatakse esialgseks genotüpiseerimiseks. tulevane genotüpiseerimine).

Geenide kloonimine

Geenide kloonimine (mitte segi ajada organismide kloonimisega) on geenide isoleerimise ja geenitehnoloogia manipulatsioonide tulemusena suure koguse antud geeni produkti saamine. PCR-i kasutatakse geeni amplifitseerimiseks, mis seejärel sisestatakse vektor- DNA fragment, mis kannab võõra geeni samasse või mõnda teise kultiveerimiseks sobivasse organismi. Näiteks kasutatakse vektoritena plasmiide ​​või viiruse DNA-d. Tavaliselt kasutatakse geenide sisestamist võõrorganismi selle geeni produkti – RNA või kõige sagedamini valgu tootmiseks. Nii saadakse palju valke tööstuslikes kogustes kasutamiseks põllumajanduses, meditsiinis jne.

Riis. 4: Geeni kloonimine plasmiidi abil. .
(1) Organismi A kromosomaalne DNA. (2) PCR. (3) Paljud organismi A geeni koopiad. (4) Geeni sisestamine plasmiidi. (5) Plasmiid organismi A geeniga. (6) Plasmiidi sisestamine organismi B. (7) Organismi A geeni koopiate arvu paljundamine organismis B.

DNA sekveneerimine

Fluorestseeruva märgise või radioaktiivse isotoobiga märgistatud dideoksünukleotiide kasutavas sekveneerimismeetodis on PCR lahutamatu osa, kuna just polümerisatsiooni käigus sisestatakse DNA ahelasse fluorestseeruva või radioaktiivse märgisega märgistatud nukleotiidide derivaadid. See peatab reaktsiooni, võimaldades pärast sünteesitud ahelate eraldamist geelis määrata konkreetsete nukleotiidide asukohti.

Mutagenees

Praegu on PCR muutunud peamiseks mutageneesi läbiviimise meetodiks. PCR kasutamine on võimaldanud mutageneesi protseduuri lihtsustada ja kiirendada, samuti muuta see usaldusväärsemaks ja reprodutseeritavamaks.

PCR-diagnostika (polümeraasi ahelreaktsioon) on üks moodsamaid uurimismeetodeid molekulaarbioloogia valdkonnas ja sellel on teiste meetodite ees mõned eelised.

Vaatame lähemalt PCR analüüsi – mis see on?

Kõigist laboriuuringutest peetakse PCR-meetodit üheks kõige täpsemaks erinevate viiruste või bakteriaalsete mõjurite poolt põhjustatud haiguste diagnoosimisel. Lisaks muutub PCR-diagnostika iga päevaga kättesaadavamaks ning suurenenud spetsiifilisuse tase tagab täpsed ja õiged tulemused, välistades valevastused.

Lisaks patogeeni DNA amplifikatsioonile kasutatakse seda diagnostilist meetodit isaduse määramisel, geenide kloonimisel, pärilike haiguste tuvastamisel jne.

Milliseid haigusi saab PCR abil diagnoosida?

Mis see siis on: PCR-analüüs ja milleks seda meetodit kasutatakse? Spetsialist võib välja kirjutada PCR-i, et tuvastada erinevaid infektsioone bakteriaalse või viirusliku päritoluga kehas. Samuti on PCR abil võimalik tuvastada kroonilisi või varjatud infektsioone. PCR-analüüs on efektiivne ka siis, kui organismis on üksikuid patogeeni rakke.

Kui sugulisel teel levivate infektsioonide tuvastamiseks on ette nähtud PCR, võib objektiks olla klamüüdia, trichomonas, candida, mükoplasma, ureaplasma, papilloomi- ja gonorröaviiruse tekitaja gardnerella.

Enne raseduse planeerimist või selle esinemist peavad tulevased vanemad läbima PCR-i diagnostilised testid nakkushaiguste esinemise kohta. Lõppude lõpuks on raseduse planeerimine tulevase ema ja lapse jaoks väga oluline eluperiood, nii et peate kontseptsiooni käsitlema vastutustundlikult. Kui naise ja mehe kehas on siiski tuvastatud nakkustekitajad, on parem raseduse planeerimine ravi ajal edasi lükata.

Lisaks suguelundite infektsioonidele saab PCR abil tuvastada ka teisi patogeene, näiteks:

• Viiruste B ja C olemasolu organismis: PCR-analüüs aitab kindlaks teha hepatiidi põhjustaja viiruse tüübi juba enne haiguse kliinilisi ilminguid; PCR-meetod aitab spetsialistil valida haiguse õige ravi ja jälgida selle tõhusust;
• Tuberkuloosi patogeenide esinemine: selle uurimismeetodiga saab tuvastada tuberkuloosi vorme, mida teised laboriuuringud ei suuda tuvastada; PCR määratakse juhul, kui inimesel on vastavad sümptomid, näiteks tõuseb kehatemperatuur, algavad põletikulised protsessid hingamisteedes, tuberkuliinitesti käigus märgitakse positiivne reaktsioon;
• inimese immuunpuudulikkuse viirus;
• Epstein-Barri viirus ja tsütomegaloviirus;
• Helicobacter.

Kuidas PCR analüüsi tehakse?

PCR-analüüsi mõistmiseks peate teadma, kuidas see uuring läbi viiakse.

Pärast materjali uurimisse võtmist viiakse see spetsiaalsesse aparaadisse, kuhu asetatakse spetsiaalsed ensüümid, mis soodustavad geneetilise materjali teket. Pärast seda hakatakse viiruse DNA-d ja RNA-d kopeerima, kuni see suureneb koguseni, mille juures on võimalik haiguse põhjustaja tuvastada.

Naistel kogutakse materjali kõige sagedamini emakakaela kanalist ja kusiti. Sel juhul on õige tulemuse saavutamiseks väga oluline protseduuriks valmistuda. Ettevalmistus sisaldab järgmist:

• 3 päeva enne PCR-testi peab naine hoiduma seksuaalvahekorrast;
• Enne protseduuri ei tohiks te urineerida;
• Pärast menstruatsiooni lõppu peaks enne uuringut mööduma 4-5 päeva.

Väärib märkimist, et vere võtmiseks pole vaja spetsiaalset ettevalmistust.

PCR vastused

Vastuste ärakiri on tavaliselt valmis järgmisel päeval. Tulemusi on ainult kaks: positiivne (kui kehas on infektsioon) ja negatiivne (kui patogeeni DNA-d ei tuvastata).

Vastates küsimusele, mis on PCR analüüs, võime kindlalt väita, et selle laboratoorse uurimismeetodi olulisust on raske üle hinnata. Sellise diagnostika abil on võimalik jälgida viiruste ja infektsioonide jaoks ettenähtud ravi rakendamist, hepatiidi ja HIV puhul eraldi.

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR, polümeraasi ahelreaktsioon) on meetod teatud DNA fragmentide (geenide) mitme koopia saamiseks bioloogilises proovis.

PCR-i kui molekulaarbioloogia meetodi olemus seisneb konkreetse geeni (DNA osa) korduv selektiivne kopeerimine spetsiaalsete ensüümide abil teatud tingimustel. in vitro. PCR-i oluline tunnus on spetsiifilise DNA lõigu (geeni) koopiate tootmine, mis vastab kindlaksmääratud tingimustele. DNA kopeerimise protsessi sünonüüm on "amplifikatsioon". DNA replikatsioon in vivo võib pidada ka võimenduseks. Erinevalt replikatsioonist amplifitseerib polümeraasi ahelreaktsiooni protsess DNA lühikesi osi (maksimaalselt 40 000 aluspaari).

Põhiprintsiibid

Seega on PCR teatud DNA fragmentide korduv kopeerimine in vitro korduvate temperatuuritsüklite ajal. Kuidas toimub reaktsiooniprotsess ühe temperatuuritsükli jooksul?

Nukleotiidahela moodustumine toimub ensüümi DNA polümeraasi abil. Töö alustamiseks vajab ensüüm aga stardiplatvormi. Platvormid on "praimerid" (külvijad) - sünteetilised oligonukleotiidid pikkusega 15-20 nukleotiidi. Peab olema kaks praimerit (edasi ja tagurpidi), need täiendavad DNA matriitsi sektsioone ja DNA polümeraas kopeerib mitu korda praimeritega piiratud DNA fragmenti. Polümeraasi töö seisneb DNA matriitsi järjestusele komplementaarsete nukleotiidide järjestikuse lisamises. Seega sünteesitakse ühes temperatuuritsüklis taas kaks uut DNA fragmenti (kuna DNA molekul on kaheahelaline, siis maatriksit on esialgu kaks). Seega koguneb katseklaasi 25-35 tsükli jooksul miljardeid koopiaid praimerite poolt määratud DNA piirkonnast. Eraldi tsükli struktuuri saab esitada järgmiselt:

1. DNA denaturatsioon (sulamine, DNA ahelate lahknemine) - 95°C - 1 või 2 minutit;
2. praimerite anniilimine (praimerid seonduvad DNA matriitsiga, selle etapi temperatuur määratakse praimeri nukleotiidse koostise järgi) - 60°C (näiteks) - 1 minut;
3. DNA pikenemine (polümeraas sünteesib DNA ahela) - 72°C - 1 minut (aeg sõltub sünteesitava fragmendi pikkusest).

Instrumendid polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi kasutamiseks laboris peaksid koosnema:

1. (või, nagu seda nimetatakse ka termotsükleriks);
2. süsteemid s jaoks (PCR tulemuste visualiseerimiseks);
3. süsteemid (PCR tulemuste analüüsimiseks);
4. (proovi ettevalmistamiseks);
5. komplekt (mehaaniline või elektrooniline).

Lisaks põhi- ja abiseadmetele PCR-labori täielikuks toimimiseks on vaja mõningaid kulumaterjale: steriilsed otsikud, katseklaasid, riiulid katseklaaside jaoks ja jaoturid.

Täisväärtusliku polümeraasi ahelreaktsiooni läbiviimiseks mõeldud tavapärases PCR laboris on reaktiivi alus ensüüm DNA polümeraas koos puhvriga, praimerid (väikesed sünteetilised DNA fragmendid, mis on komplementaarsed DNA matriitsi analüüsitava lõigu alguse ja lõpuga), nukleotiidide segu (A, T, G, C). Puhastatud vesi on samuti hädavajalik.

PCR-meetodi eelised

Uuringu kõrge tundlikkus

Meetodi tundlikkus on selline, et PCR-iga on võimalik amplifitseerida ja identifitseerida sihtjärjestus isegi siis, kui see esineb üks kord 105 rakust koosnevas proovis.

Analüüsi spetsiifilisus

PCR võimaldab tuvastada konkreetse nakkustekitaja DNA teiste mikroorganismide DNA ja peremeesorganismi DNA juuresolekul, samuti teostada genotüpiseerimist. Spetsiaalselt reaktsioonikomponentide (praimerite) valimisel saate samaaegselt tuvastada lähedalt seotud mikroorganismide DNA-d.

PCR-meetodi mitmekülgsus

Fakt on see, et nakkushaiguste või inimese pärilike haiguste PCR-diagnostika jaoks saate kasutada samu seadmeid, järgida proovide ettevalmistamise ja analüüsimise universaalseid protseduure, samuti sama tüüpi reaktiivide komplekte.

Säästa aega

PCR-i oluline eelis on kultuurilise mikrobioloogilise töö etappide puudumine. Proovide ettevalmistamine, reaktsiooni läbiviimine ja tulemuste analüüs on tehtud võimalikult lihtsaks ja suures osas automatiseeritud. Tänu sellele saab tulemuste saavutamiseks kuluvat aega lühendada 4-5 tunnini.

PCR-meetodi efektiivsus

Uuritud kliinilise materjali laius

Polümeraasi ahelreaktsioonis ei saa proovina kasutada mitte ainult patsiendi bioloogilist materjali, vaid ka paljusid teisi substraate, milles DNA molekule saab kõrge tundlikkusega tuvastada, näiteks vesi, muld, toit, mikroorganismid, tampoonid ja palju muud. .

Kõik selle ainulaadse meetodi ülaltoodud eelised - kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus, nakkustekitaja tuvastamine ja mis tahes inimese geeni genotüpiseerimine, kõrge efektiivsus ja aja kokkuhoid, instrumentide baasi mitmekülgsus - võimaldavad PCR-meetodit tänapäeval laialdaselt kasutada kliinilises praktikas. diagnostika, meditsiinipraktika, teadusuuringud, kontrolli kvaliteet ja paljud teised valdkonnad.

PCR rakendamine

Polümeraasi ahelreaktsiooni kui kaasaegse molekulaarbioloogia meetodi rakendusalad on mitmekesised. See on suuresti tingitud analüüsitava materjali laiusest (uurimisobjektiks võib saada peaaegu kõik, millest saab eraldada enam-vähem kvaliteetse DNA), aga ka valitud praimerid. PCR-i peamised rakendusvaldkonnad:

kliiniline meditsiin

• nakkushaiguste diagnoosimine
• pärilike haiguste diagnoosimine
• mutatsiooni tuvastamine
• genotüpiseerimine
• rakutehnoloogiad
• geneetiliste passide loomine

ökoloogia

• keskkonnaseire
• toidu analüüs
• geneetiliselt muundatud organismide (GMO) analüüs

kohtumeditsiin ja kriminoloogia

• isikutuvastus
• isaduse tuvastamine

farmakoloogia

veterinaarmeditsiin

teadusuuringud (molekulaarbioloogia, geneetika)

PCR labori korraldamine

Tänapäeval on PCR (polümeraasi ahelreaktsiooni) meetod üks kõige informatiivsemaid ja täpsemaid viise nakkuse määramiseks inimkehas. Võrreldes teiste testidega puudub sellel tundlikkuse piirang, mis võimaldab tuvastada nakkustekitaja DNA-d ja selle olemust.

PCR - meetodi põhimõte

Meetodi olemus seisneb uurimiseks saadud bioloogilises materjalis patogeeni DNA lõigu määramises ja korduvas suurendamises. PCR-meetodil molekulaardiagnostikat tehes saate hõlpsalt dešifreerida mikroorganismide DNA ja RNA. Kuna igal neist on oma ainulaadne geneetiline detektor, mis identse fragmendi tuvastamisel bioloogilises proovis alustab tohutu hulga koopiate loomise protsessi. Sellega seoses tagab meetodi spetsiifilisus täpse tulemuse, isegi kui proovis tuvastati ainult üks nakkuse DNA fragment.

Lisaks hõlmab PCR-meetodit kasutav molekulaardiagnostika ja selle järgnev dekodeerimine nakkustekitaja tuvastamist inkubatsiooniperioodil, kui haiguse kliinilisi ilminguid pole.

PCR läbiviimise äärmiselt oluline tingimus on materjali eelnev ettevalmistamine ja õige kogumine.

PCR meetod – kuidas seda võetakse?

Meetodi üheks oluliseks eeliseks on asjaolu, et uurimiseks sobib täiesti erinev bioloogiline materjal. See võib olla emakakaela või kusiti, uriini või vere määrimine. Kõik sõltub kahtlustatavast patogeenist ja selle elupaigast.

Sugulisel teel levivate infektsioonide määramiseks PCR meetodil võetakse reeglina suguelundite eritist, viirusliku C-hepatiidi või HIV tuvastamiseks võetakse verd.

On selge, et PCR on paljulubav ja kõrgtehnoloogiline uurimismeetod, mida on lihtne kasutada ja millel on ka kõrge tundlikkus. Lisaks praktilisele meditsiinile kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni teaduslikel eesmärkidel.