Jak řekl jeden student během zkoušky z biologické chemie, „enzym je, když je něčeho velmi málo, ale dokáže pohnout horou“. Student nebyl za takovou definici pochválen, ale podstatu věci uchopil správně - enzymy mnohonásobně urychlují reakci mezi látkami, která bez nich buď vůbec neprobíhá, nebo probíhá mnohonásobně pomaleji.
Prvním enzymem s lytickým účinkem na buněčné stěny bakterií byl lysozym, objevený v roce 1922 slavným anglickým mikrobiologem Alexandrem Flemingem, který jako první objevil lysozym v mnoha tkáních a sekretech živočišných organismů a navrhl, že jde o ochranný prostředek umožňující vyšší organismy bojovat proti existujícím v jejich stanovišti patogenními bakteriemi. Je zajímavé, že tento Flemingův objev byl učiněn téměř o 10 let dříve než jeho druhý, slavnější vědecký úspěch – objev a rozluštění struktury (spolu s H.W. Floreyem a E.B. Cheynem) penicilinu, prvního a nejrozšířenějšího následně antibiotika. První zprávy o tom, že bakterie mají schopnost produkovat bakteriolytické enzymy, se začaly objevovat již na počátku 50. let. Dosud byly nalezeny u všech studovaných bakterií.
V tomto případě může být enzym ve srovnání s množstvím interagujících látek zanedbatelně malý - hmotnostně milionkrát nižší. A co je obzvláště zajímavé, množství enzymu neubývá: jedna z jeho molekul může reakci posloužit mnohokrát a být znovu připravena k práci (takto bude dobrý mlýn stále znovu a znovu mlít nová zrna bez znatelného opotřebení mlýnské kameny).
To znamená, že tyto speciální sloučeniny jsou klasifikovány jako katalyzátory – urychlovače chemických reakcí. Takové katalyzátory jsou známé i v neživé přírodě, proto se ty, které se nacházejí pouze u živých bytostí, nazývají biokatalyzátory. Svým složením jsou to proteiny. Každá reakce vyžaduje svůj vlastní enzym: hodí se k němu jako klíč k zámku. Proto existuje velké množství takových katalytických proteinů v rostlinách, zvířatech a mikrobech.
Doposud však nebyl zcela prozkoumán mechanismus, jakým k reakci dochází. Někteří vědci se domnívají, že velké molekuly enzymů jsou jakýmsi místem setkání molekul látek zapojených do reakce. Existují další předpoklady. Nebudeme je rozebírat, ale uděláme obecný závěr: pro život každého organismu je potřeba spousta enzymů a jejich soubor určí i způsob výživy mikroorganismu.
Ti mikrobi, kteří k výživě vyžadují pouze anorganické sloučeniny – kyslík, roztoky určitých solí, síra – se nazývají autotrofové (v překladu do ruštiny tento název znamená: ti, kteří se živí).
Autotrofy staví své proteiny a nukleové kyseliny, dalo by se říci, z ničeho – z dusíkatých sloučenin, vody, kyslíku... Je to jako stavět Cheopsovu pyramidu z drobných cihel (a ne z mnohatunových kamenných bloků, ze kterých je ve skutečnosti složena ). Můžete dokonce spočítat, kolikrát je celá „pyramida“ (řekněme obrovská molekula deoxyribonukleové kyseliny – a jak dlouhý název!) větší než jedna „cihla“ – molekula oxidu uhličitého nebo čpavku.
Molekulová hmotnost deoxyribonukleové kyseliny (obvykle zkráceně DNA) v bakteriích je 1000 milionů; molekulová hmotnost oxidu uhličitého je 44. To znamená, že celá „budova“ je 20 milionůkrát větší než „cihla“ (lze připomenout, že na vícepodlažní budovu se nyní utratí asi 100 tisíc cihel). A celá molekulární struktura je „postavena“ za pouhou půlhodinu (doba potřebná k tomu, aby bakteriální buňka vytvořila svůj vlastní druh).
Pokud mluvíme o umístění bakteriolytických enzymů v bakteriální kultuře, pak bychom je měli v tomto ohledu především rozdělit do tří skupin.
První skupinu tvoří autolysiny – bakteriolytické enzymy, které jsou vždy přítomny (v aktivním nebo neaktivním stavu) v samotné buněčné stěně. Účastní se procesu růstu a diferenciace bakteriálních buněk. V bakteriální buňce zjevně normálně existuje vztah mezi aktivitami enzymů, které ničí a syntetizují složky buněčné stěny. Inkorporace nově syntetizovaných materiálů do buněčné stěny totiž nemůže nastat bez předběžného rozštěpení určitých chemických vazeb.
Procesy lýzy a biosyntézy stěny probíhají současně s růstem a vývojem bakteriální buňky a teprve v pozdějších fázích vývoje, kdy biosyntetické procesy odezní a aktivita lytických enzymů zůstává na stejné úrovni, dochází k lýze se vyskytuje bakteriální buňka.
Do druhé skupiny patří lytické enzymy bakteriálních spor. Aktivují se spolu s dalšími enzymy, které se podílejí na degradaci biopolymerů v období sporulace (tvorba spor) a při klíčení bakteriálních spor. Tyto enzymy se účastní procesů destrukce membrány a jako autolysiny procesů růstu a morfogeneze bakteriální buňky.
Konečně třetí skupinou jsou extracelulární lytické enzymy. Jejich biologická role zřejmě spočívá v tom, že bakterie, které syntetizují a vylučují takové enzymy do prostředí, mají oproti jiným bakteriím výhodu, především v potravinových zdrojích. Bakterie, která produkuje lytické enzymy, ničí buňky jiných bakterií, využívá aminokyseliny, sacharidy a další složky lyžované buňky pro svou potřebu. Tato skupina bakteriolytických enzymů navíc hraje naprosto důležitou roli při ochraně buněk, které tyto enzymy vylučují do prostředí před jinými bakteriemi žijícími ve stejné ekologické nikě.
Úvod do práce
Stav problému a závažnost problému
Lytické enzymy*, které ničí bakteriální buněčné stěny, byly poprvé objeveny v lidských slinách a popsány Alexanderem Flemingem v roce 1922 (Fleming, 1922). Látka byla pojmenována lysozym, což znamená „enzym, který rozpouští bakterie“. V roce 1929 Fleming poprvé popsal antibakteriální vlastnosti houby Penicillum notatum - výrobce prvního průmyslového antibiotika penicilinu, za který mu byla v roce 1945 ve spolupráci s Ernestem Chainem a Howardem Floreym udělena Nobelova cena. Po uvolnění penicilinu a dodnes se neustále pracuje na tvorbě a výrobě nových antibiotik, což je způsobeno nejen nutností získat látky požadované specifičnosti a nejlepší kvalita, ale také neustálým vznikem patogenních mikrobů odolných vůči jakémukoli, i nejnovějšímu antibiotiku (). Vzniklá nepříznivá situace v léčbě infekčních onemocnění nás nutí hledat nová účinná antimikrobiální činidla. Mnoho výzkumníků poukazuje na vyhlídky použití lytických enzymů pro tyto účely, protože způsob jejich působení na mikroby, konkrétně rozpouštění mikrobiální buňky, nám umožňuje doufat, že nedojde k výskytu patogenů odolných vůči nim.
* Termín „lytické enzymy“ nyní označuje hydrolázy, které ničí strukturní polymery buněčných stěn různých mikroorganismů. Podle toho, které mikroorganismy ničí, se lytické enzymy dělí na bakteriolytické, kvasinkové a mykolytické. Na základě jejich substrátové specifity je lze rozdělit na chitinázy, proteázy, peptidoglykanhydrolázy a glukanázy. To závisí na tom, které polymery, které tvoří buněčné stěny různých mikroorganismů, jsou ničeny lytickými enzymy. Naopak například peptidoglykanové hydrolázy, které ničí peptidoglykan - strukturní složku bakteriálních buněčných stěn, podle toho, jakou vazbu v molekule peptidoglykanu hydrolyzují, se dělí na glykosidázy (N-acetylglukosaminidázu a N-acetylmuramidázu (lysozymy)), amidázy a endopeptidázy. Za zmínku stojí zejména bakteriolytické proteázy. Mezi velkým počtem v současnosti známých proteáz je velmi málo bakteriolytických. Ale právě tyto enzymy v lytické skupině mají nejširší spektrum účinku proti mikroorganismům. Jsou schopny ničit buněčné membrány bakterií, kvasinek, vláknitých hub a prvoků.
V závislosti na kontextu budou v této práci použity termíny „lytické enzymy“, „bakteriolytické enzymy“, „peptidoglykanhydrolázy“, „kvasinkové enzymy“, „lytické proteázy“.
V období od 5. do 70. let 20. století se intenzivně pracovalo na hledání producentů takových enzymů, jejich izolaci a studiu jejich vlastností. Nyní je známo, že mnoho živých organismů – od virů po člověka – produkuje lytické enzymy. Mezi bakteriemi byli nalezeni producenti enzymů, kteří aktivně lyžují nejen buňky konkurenčních bakterií, ale i buňky mikroorganismů jiných systematických skupin - kvasinek, vláknitých hub a prvoků. Pro takové bakterie byla v roce 1978 vytvořena objednávka Lysobacterales, včetně rodiny Lysobacteraceae a rodina Lysobacter, kombinující čtyři druhy (Christensen a Cook, 1978). Do této systematické skupiny byly přeneseny bakterie, které dříve patřily k jiným rodům, ale v řadě vlastností a hlavně lytické schopnosti se od svých typických zástupců lišily. Následně zájem o lýzu bakterií poněkud opadl, ale nyní se opět staly předmětem zájmu výzkumníků. Během prvního desetiletí 21. století bylo identifikováno jedenáct nových druhů rodu Lysobacter. V důsledku pokračující práce na systematizaci známých mikroorganismů bylo také opraveno systematické postavení rodu Lysobacter. Nyní je součástí rodiny Xanthomonadaceae(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001).V literatuře lze stále pozorovat zřejmý zmatek v systematickém postavení popsaných producentů lytických enzymů.Například producent enzymů se všemi vlastnostmi podobnými enzymům typových druhů rodu Lysobacter - Lysobacter enzymogenes - označena autory jako Achromobacter lyticus(Shiraki ach, 2002, Lief or/., 1997).
Pro bakterie produkující extracelulární lytické enzymy, jako je např
Pro všechny bakterie jsou intracelulární autolytické enzymy životně potřebné ke zničení kovalentních vazeb v peptidoglykanu, hlavní strukturální složce jejich buněčné stěny, a hrají tak hlavní roli v procesech růstu a dělení. V buňkách bakterií, které produkují extracelulární lytické enzymy, dochází k paralelní syntéze a pohybu cytoplazmatickou membránou k místu jejich působení jak autolytických enzymů, které mohou být lokalizovány v membráně, periplazmě a buněčné stěně, tak extracelulárních bakteriolytických enzymů. vylučované do prostředí. V tomto ohledu je logickou otázkou mechanismus a regulace procesu současného fungování těchto enzymů, zda autolytické enzymy mohou být prekurzory extracelulárních bakteriolytických enzymů? Dosud bylo publikováno velké množství prací o izolaci a charakterizaci jak extracelulárních, tak intracelulárních bakteriolytických enzymů bakterií. Nicméně zatím
V současné době neexistují žádné informace o srovnávací studii extra- a intracelulárních lytických systémů u stejné bakterie. Autolytické enzymy byly dobře studovány u mnoha zástupců grampozitivních bakterií (Shockman a Holtje, 1994), s výjimkou tzv. Escherichia coli(Holtje, Tuomanen, 1991), nebyly podrobně studovány.
V roce 1973 byla v Ústavu biofyzikální medicíny Akademie věd SSSR (IBFM RAS) na příkaz Akademie věd zahájena práce na tématu „Vytvoření účinných prostředků pro boj s patogenními mikroorganismy množícími se rezistentní vůči antibiotikům“. Kultivační kapalina gramnegativní bakterie izolované v roce 1976 z vody řeky Oka v regionu léčebná zařízení Pushchino, Moskevská oblast, byl základem léku zvaného lysoamidáza a má bakteriolytické a proteolytické účinky. Úspěšné klinické studie lysoamidázy umožnily její registraci jako lék pro léčbu vnějších infekcí způsobených grampozitivní mikroflórou. Na základě řady morfologických a biochemických charakteristik byla produkující bakterie pravděpodobně zařazena do rodu Xanthomonas. V řadě významných vlastností, například nedostatkem motility, se však producent lysoamidázy od bakterií tohoto rodu lišil.
Účel a cíle práce
Účelem práce je studium biochemických a genetických rysů fungování a vztahu intracelulárního a extracelulárního lytického systému bakterie produkující léčivo lysoamidázu za účelem vytvoření nové generace antimikrobiálních léčiv na základě získaných informací.
Hlavní cíle:
objasnění taxonomické pozice produkující bakterie;
stanovení struktury peptidoglykanu produkující bakterie - substrátu autolytických enzymů;
izolace a charakterizace extracelulárních lytických enzymů produkující bakterie;
izolace a charakterizace intracelulárních (autolytických) enzymů producenta;
stanovení genové struktury extracelulárních lytických enzymů
výrobce;
studium vlastností interakce lytických enzymů s
různé cílové mikroorganismy;
získání rekombinantních lytických enzymů producenta a studium
jejich vlastnosti pro posouzení možnosti použití takových enzymů jako
základy nových antimikrobiálních léků;
studium možnosti využití lysoamidázy a různých forem lytických enzymů výrobce pro léčbu „vnitřních“ infekcí na příkladu antraxu.
Vědecká novinka díla
Na základě zjištěných morfologických, biochemických a genetických vlastností byla bakterie produkující antimikrobiální léčivo lysoamidázu zařazena do rodu Lysobacter. Kmen studovaný v této práci Lysobacter sp. XL1 byl získán selekcí z původní kultury a uložen do All-Russian Collection of Microorganisms (VKM V-2249D). Bylo zjištěno, že během dlouhodobé kultivace tohoto lyticky vysoce aktivního kmene na médiu, které podporuje sekreci extracelulárních produktů, se buňky lyticky málo aktivního kmene objevují a hromadí v populaci v důsledku vyšší rychlosti růstu Lysobacter sp. XL2.
Endocelulární a exocelulární lytické systémy téže bakterie byly poprvé charakterizovány na příkladu Lysobacter sp. XL1 a XL2. V endocelulárním systému obou kmenů bylo identifikováno devět enzymů různé substrátové specifity a lokalizace (glukosidázy, amidázy, endopeptidázy). Jako součást extracelulárního lytického systému Lysobacter sp. XL1 našel pět enzymů, včetně muramidázy (L3), amidázy (L2) a tří endopeptidáz (L1, L4, L5). Extracelulární lytický systém kmene s nízkou aktivitou Lysobacter sp. XL2 se skládá z muramidázy a amidázy. Vlastnosti enzymů různých lytických systémů se od sebe výrazně liší: intracelulární enzymy jsou kyselé proteiny, aktivní při 29C, teplotě optimálního růstu bakterií, vysoké iontové síle média a alkalickém pH; extracelulární enzymy - alkalické proteiny, aktivní při nízké iontové síle, alkalickém pH a vysoké teploty(50-80 °C).
Poprvé bylo odhaleno, že postsekreční elektrostatická interakce vysokomolekulárního kyselého polysacharidu a enzymů Lysobacter sp. XL1 vede nejen k výrazné stabilizaci enzymů, ale v některých případech i ke změně jejich aktivity. Polysacharid zvyšuje účinek muramidázy na buňky Staphylococcus aureus a lytické enzymy spojené s polysacharidem jsou schopné ničit spící spory bakterií rodu Bacil. Polysacharid Lysobacter sp. XL1 zcela inhibuje aktivitu řady lytických enzymů jiných výrobců. Je zřejmé, že tvorba takových extracelulárních komplexů mikroorganismy je pro ně ekologicky významná.
Poprvé se ukázalo, že extracelulární lytické enzymy L2 a L5 Lysobacter sp. vstoupit do prostoru obklopujícího buňku uvnitř váčků vnější membrány vytvořených bakterií. Enzymy uzavřené ve váčcích jsou schopny lyžovat živé buňky zástupců různých skupin mikroorganismů, například gramnegativních bakterií rodů Pseudomonas, Proteus, Erwinia, Alcaligenes, grampozitivní bakterie patřící do rodů Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Rothayibacter, rod kvasinek Candida, vláknitá houba Sclerotinia sclerotiorum, na rozdíl od lytických enzymů umístěných mimo vezikuly. Taková cesta pro sekreci lytických enzymů má tedy důležitý biologický význam pro produkční buňku, protože rozšiřuje rozsah mikroorganismů, se kterými může v přírodě soutěžit.
Byly stanoveny důležité rysy interakce extracelulárních lytických enzymů Lysobacter sp. s nativními cílovými buňkami. Pro účinnou hydrolýzu Gram-pozitivních bakteriálních buněk vyžadují enzymy předběžný kontakt s negativně nabitým polymerem buněčné stěny (kyseliny teichoové nebo teichuronové) a chemická struktura polymeru není kritická. Nativní buňky gramnegativních bakterií lytické enzymy Lysobacter sp.(3a s výjimkou L5) jsou zničeny pouze tehdy, je-li vnější membrána cílové buňky předem destabilizována vhodnou metodou (teplota, polymyxin B, gentamicin, amikacin). Lytický enzym L5 ničí buňky gramnegativních bakterií bez předchozího ošetření.
Praktický význam práce
Na základě získaných dat byl vyvinut a rozšířen nový předpis pro výrobu léčiva lysoamidázy s vysokým výtěžkem cílového produktu (až 80 %).
Byly vyvinuty způsoby pro produkci dvou rekombinantních lytických endopeptidáz Lysobacter sp. XLl využívající heterologní systémy založené E-coli(refolding z inkluzních tělísek) a Pseudomonas fluorescens(čištění vylučovaných proteinů).
Byla stanovena možnost použití léku lysoamidázy, stejně jako vezikul Lysobacter sp. XLl pro léčbu různých forem experimentálního antraxu.
Na základě materiálů disertační práce byly získány RF patenty: č. 2139348 (1999), č. 2193063 (2002), č. 2296576 (2007), č. 2407782 (2010), č. 2408725 (2011), patent USA č. 7 150 985 B2 (2006), čínský patent č. 274608 (2006), evropský patent č. 1902719 B1 (2011).
Nová data získaná v práci jsou použita v kurzech biochemie na Biologické fakultě Moskevské státní univerzity pojmenované po M.V. Lomonosova a biologických fakult jiných vysokých škol.
Schválení práce
Materiály disertační práce byly prezentovány na třetí a čtvrté celosvazové konferenci „Biosyntéza enzymů mikroorganismy“, Kobuleti, 1986; Taškent, 1988; Druhá celosvazová konference „Rány a infekce ran“, Moskva, 1986; 14 Mezinárodní biochemický kongres, Praha, ČSSR, 1988; Celosvazová konference „Regulace mikrobiálního metabolismu“, Pushchino, 1989; Fifth International Conference on Chemistry and Biotechnology of Active Natural Compounds, Varna, Bulharsko, 1989; 1 Mezinárodní sympozium „Molekulární organizace biologických struktur“, Moskva, 1989; 5 Evropský kongres o biotechnologii, Kodaň, 1990; Mezinárodní konference o antimikrobiální aktivitě neantibiotik, Kodaň, 1990; Konference „Biosyntéza a degradace mikrobiálních polymerů. Základní a aplikované aspekty“, Pushchino, 1995; Mezinárodní konference "Mikrobiální polysacharid", Kanada, 1995; První mezinárodní konference "Polysaccharide Engineering" Trondheim, Norsko, 1995; Konference chirurgů, Kaluga, 1996; IV Symposium „Chemie proteolytických enzymů“, Moskva, 1997; Druhý kongres Biochemické společnosti Ruské akademie věd, Moskva, 1997;
seminář-prezentace inovativních vědeckých a technických projektů
„Biotechnologie Moskevské oblasti-97“, Pushchino, 1997; Mezinárodní sympozium „Moderní problémy mikrobiální biochemie a biotechnologie“, Pushchino, 2000; mezinárodní konference „Biotechnologie na přelomu dvou tisíciletí“, Saransk, 2001; 3 Kongres Biochemické společnosti, Petrohrad, 2002; Všeruská konference „Problémy lékařské enzymologie. Moderní technologie laboratorní diagnostiky nového století“, Moskva, 2002; Druhý, pátý, šestý moskevský mezinárodní kongres „Biotechnologie: stav a vyhlídky rozvoje“, Moskva, 2003, 2009, 2011; První celoruský kongres „Pokroky v lékařské mykologii“, Moskva, 2003; III konference „Biotechnologie: stav a perspektiva vyšetřování“, Moskva, 2005; Třetí celoruská školní konference „Chemie a biochemie sacharidů“, Saratov, 2004; konference "Základní vědy v medicíně", Moskva, 2005; konference „Výsledky základního a aplikovaného výzkumu pro tvorbu nových léků“, Moskva, 2008; Všeruská konference „Ekotoxikologie-2010“, Tula, 2010; Konference "Základní vědy - Medicína", Moskva, 2010, Všeruské sympozium s mezinárodní účastí "Biologicky aktivní látky mikroorganismů: minulost, přítomnost, budoucnost", Moskva, 2011.
Publikace
Struktura a rozsah práce
Federální agentura pro vzdělávání
Státní vzdělávací instituce
vyšší odborné vzdělání
Státní technická univerzita v Permu
Ústav chemie a biotechnologie
Abstraktní:
Lytické enzymy. Lysozym
Provedeno:
student skupiny HTBmPiB-05
Ševčenko I.K.
Dozorce:
Ph.D. Gryaznova D.V.
Perm, 2010
Lytické enzymy mikrobiálního původu 5
Objevitelský příběh 5
Lokalizace a fyziologická úloha bakteriolytických enzymů v bakteriálních kulturách 6
Vliv struktury buněčných stěn bakterií na lytickou schopnost enzymů 7
Peptidoglykan bakteriálních buněčných stěn. 8
Substrátová specificita bakteriolytických enzymů 9
Objev bakteriolytického komplexu "Lysoamidáza" 10
Perspektivy využití lysoamidázy v medicíně 10
LYSOZYM 12
Mechanismus lýzy 13
Závěr. 15
Literatura. 16
Jsou známy různé fyzikální a biochemické metody ničení mikrobiální biomasy. Enzymatická metoda ničení buněčných stěn na rozdíl od fyzikálně-chemických metod umožňuje řízené působení na buňky a extrakci cílových produktů z nich.
Mezi enzymy produkovanými mikroorganismy zaujímají zvláštní místo lytické enzymy, které katalyzují biochemické reakce sekvenční degradace strukturních prvků mikrobiální buněčné stěny.
Použití lytických enzymových přípravků umožňuje zintenzivnit uvolňování mnoha cenných fyziologicky aktivních látek z mikrobiální biomasy: enzymů, vitamínů, aminokyselin atd. Je známo, že buněčná stěna krmných kvasinek brání vstřebávání cytoplazmatických látek při krmení zvířaty. Biomasa krmných kvasinek po enzymatické lýze buněčných stěn má zvýšenou nutriční hodnotu, což umožňuje její efektivnější využití při výrobě krmiv, mimo jiné jako součást plnotučných náhražek mléka pro mladá hospodářská zvířata.
Také lytické enzymy lze využít v technologiích ochrany životního prostředí, ve fázích využití mikrobiální biomasy, která je odpadem mikrobiologické produkce.
Kromě toho byla nedávno vyvinuta antimikrobiální léčiva na bázi lytických enzymů, mimo jiné pro léčbu dermatomykózy, která mají řadu výhod oproti chemicky syntetizovaným fungicidům. Pozitivní výsledky byly dosaženy při jejich použití k léčbě onemocnění trávicího traktu hospodářských zvířat. Slibné je použití lytických enzymů v boji proti stafylokokovým infekcím a při léčbě zubního kazu.
Zvláště zajímavé pro vytvoření průmyslové výroby enzymů jsou termotolerantní mikroorganismy, včetně aktinomycet, které produkují lytické enzymy, které mají vysokou rychlost růstu a odolnost vůči změnám teploty kultivace. Je také důležité, že termotolerantní plodiny se často ukazují jako konkurenceschopnější ve srovnání s mezofilními producenty, pokud jde o infikování mikroflóry.
Ukázalo se, že enzymy ničící buněčnou stěnu (lytické) se nacházejí ve významném množství v těchto strukturách samotných, v těsné blízkosti objektů jejich působení. Takové enzymy se nazývají endogenní (intracelulární). Kromě toho bylo zjištěno, že některé z lytických enzymů jsou exogenní, to znamená, že se vylučují (uvolňují) do prostředí organismů, které je tvoří.
Pokud mluvíme o umístění bakteriolytických enzymů v bakteriální kultuře, pak bychom je měli v tomto ohledu především rozdělit do tří skupin.
První skupinu tvoří auto lyzuje - bakteriolytické enzymy, které jsou vždy přítomny (v aktivním nebo neaktivním stavu) v samotné buněčné stěně. Účastní se procesu růstu a diferenciace bakteriálních buněk. V bakteriální buňce zjevně normálně existuje vztah mezi aktivitami enzymů, které ničí a syntetizují složky buněčné stěny. Inkorporace nově syntetizovaných materiálů do buněčné stěny totiž nemůže nastat bez předběžného rozštěpení určitých chemických vazeb.
Procesy lýzy a biosyntézy stěny probíhají současně s růstem a vývojem bakteriální buňky a teprve v pozdějších fázích vývoje, kdy biosyntetické procesy odezní a aktivita lytických enzymů zůstává na stejné úrovni, dochází k lýze se vyskytuje bakteriální buňka.
Do druhé skupiny patří lytické enzymy bakteriálních spor . Aktivují se spolu s dalšími enzymy, které se podílejí na degradaci biopolymerů v období sporulace (tvorba spor) a při klíčení bakteriálních spor. Tyto enzymy se účastní procesů destrukce membrány a jako autolysiny procesů růstu a morfogeneze bakteriální buňky.
Konečně je třetí skupina extracelulární lytické enzymy . Jejich biologická role zřejmě spočívá v tom, že bakterie, které syntetizují a vylučují takové enzymy do prostředí, mají oproti jiným bakteriím výhodu, především v potravinových zdrojích. Bakterie, která produkuje lytické enzymy, ničí buňky jiných bakterií, využívá aminokyseliny, sacharidy a další složky lyžované buňky pro svou potřebu. Tato skupina bakteriolytických enzymů navíc hraje naprosto důležitou roli při ochraně buněk, které tyto enzymy vylučují do prostředí před jinými bakteriemi žijícími ve stejné ekologické nikě.
U některých grampozitivních bakterií (například Staphylococcus aureus) se teichoové kyseliny skládají z několika desítek molekul ribitolfosfátu - ribitolteichoových kyselin, u jiných grampozitivních bakterií se tyto biopolymery skládají z molekul glycerolfosfátu (glycerolteichoové kyseliny). Teichoové kyseliny jsou přítomny pouze v grampozitivních bakteriích.
Hlavním rozdílem ve struktuře membrán grampozitivních a gramnegativních bakterií je přítomnost druhé, takzvané vnější membrány, kromě cytoplazmatické bakterie. Tato struktura, umístěná nad tenkým, jedno- až třívrstvým peptidoglykanovým vakem (8 nm), je typickou dvouvrstvou membránou, ve které bylo identifikováno několik poměrně unikátních složek: lipopolysacharidy, lipoproteiny a také proteiny - poriny, ze kterých se tvoří póry ve vnější membráně umožňující pronikání do schránky (a z ní do okolí) relativně nízkomolekulárním sloučeninám.
Bakteriolytické enzymy nemohou hydrolyzovat peptidoglykanovou vrstvu v celých buňkách gramnegativních bakterií bez odstranění vnější membrány, čehož lze dosáhnout pouze ošetřením těchto buněk chelatačními činidly, detergenty nebo fyzikálními metodami.
Jak již bylo zmíněno výše, peptidoglykan se skládá z polysacharidových řetězců a peptidových můstků, které spojují celou strukturu do jediného „sáčku“ obklopujícího vnější stranu bakteriální buňky. Polysacharidové (glykanové) řetězce jsou tvořeny střídáním dvou „cihel“ – derivátů glukózy obsahujících dusík: N-acetylglukosaminu a N-acetylmuramové kyseliny – a obecně představují strukturu podobnou chitinu. To je zajímavé z evolučního hlediska, protože chitin a chitinu podobné struktury jsou rozšířeny téměř ve všech zástupcích živého světa (kromě rostlin) a jsou jedním z nejběžnějších biopolymerů na Zemi.
Struktura peptidoglykanových glykanových řetězců většiny studovaných bakterií je stejná. Peptidová část peptidoglykanu se může u různých bakterií významně lišit. Ve všech případech se však tvoří ze 4-5 zbytků L- nebo D-aminokyselin. Tyto krátké peptidy jsou na jedné straně spojeny amidovou vazbou s karboxylem kyseliny muramové svou volnou skupinou NH2 a na druhé straně jsou spojeny se stejným krátkým peptidem sousedního glykanového řetězce. U grampozitivních bakterií, zejména u Staphylococcus aureus, se peptidy spojené s glykanovými řetězci nevážou na sebe přímo, ale za účasti dalšího peptidu, tzv. cross-linking bridge. U Staphylococcus aureus se tento peptidový můstek skládá z pěti molekul nejjednodušší aminokyseliny glycinu. Přítomnost takových můstků v peptidoglykanové struktuře grampozitivních bakterií způsobuje, že se zdá hustší, což je jeden z nejdůležitějších důvodů pro zadržování barviva těmito konkrétními buňkami při barvení Gramem. Hydrolýza (štěpení vodou) určitých vazeb v peptidoglykanu vede k degradaci buněčné stěny a lýze bakterií.
V současné době je jedním z nejdůležitějších problémů medicíny velmi rychlý vznik rezistence (imunity) vůči antibiotikům používaným v lékařské praxi u klinických forem patogenních bakterií. Například ve většině porodnic jak v Rusku, tak v jiných zemích je z výše uvedených důvodů stále obtížnější bojovat s hnisavými infekcemi způsobenými zejména bakteriemi, jako jsou stafylokoky a streptokoky. Zároveň bylo prokázáno, že léčivo lysoamidáza velmi účinně lyžuje více kmenů stafylokoků rezistentních na antibiotika a dalších grampozitivních patogenních bakterií.
Lysoamidáza účinně zabíjí klinické kmeny, na které nepůsobí téměř všechna antibiotika používaná na ruských klinikách v jakékoli koncentraci. Další lékařské, biologické a klinické testy tohoto léku vedly lékaře k závěru, že lysoamidáza je vynikajícím prostředkem v boji proti hnisavým infekcím. Najde široké uplatnění v hnisavé chirurgii, stomatologii, gynekologii při léčbě obtížně se hojících trofických vředů atd. V současné době je lék schválen pro použití v lékařské praxi a jeho výroba byla založena v závodě Vyshnevolotsk enzymových přípravků pro lékařské účely.
Během lékařského, biologického a klinického testování léku se ukázalo, že má nejen lytický účinek na patogenní bakterie, ale také dobře čistí rány od nekrotické (mrtvé) tkáně a také stimuluje hojení ran a má silný imunostimulační účinek.
Ukázalo se, že účinné čištění ran od nekrotických hmot (skládajících se primárně z denaturovaných proteinů) je spojeno s přítomností v lysoamidázovém přípravku nejen bakteriolytických enzymů, ale také proteáz (enzymy degradující proteiny). A imunostimulační aktivita lysoamidázy je způsobena přítomností polysacharidu v léku. Pro možnost využití lysoamidázy v medicíně má zásadní význam přítomnost polysacharidu, neboť bakteriolytické enzymy přítomné v lysoamidáze jsou elektrostaticky vázány na polysacharid, což vede k jejich výrazné stabilizaci. Po oddělení od polysacharidu ztrácejí bakteriolytické enzymy lysoamidáza, stejně jako jejich další dříve známé analogy, svou enzymatickou aktivitu po několika dnech. Jako součást lysoamidázy si tyto enzymy zachovávají svou aktivitu v chladu prakticky nezměněnou několik let, což je povinný požadavek na léčivé přípravky.
Objeven v roce 1922 Alexandrem Flemingem v hlenu z nosní dutiny a poté nalezený v mnoha tkáních a tekutinách lidského těla (chrupavka, slezina, leukocyty, slzy), v rostlinách (zelí, tuřín, ředkev, křen), v některých bakteriích a fágy a v největším množství ve vaječném bílku. Lysozym z různých zdrojů se liší ve struktuře, ale jsou podobné v účinku. Lysozym vaječného bílku je prvním enzymem, u kterého byla rentgenovou difrakční analýzou stanovena trojrozměrná struktura a byl odhalen vztah mezi strukturou a mechanismem účinku (1965); Tyto studie jsou významným příspěvkem k pochopení mechanismů enzymatické katalýzy obecně.
Lysozym je protein s molekulovou hmotností přibližně 14 000; jeden polypeptidový řetězec se skládá ze 129 aminokyselinových zbytků a je složen do kompaktní globule (30 × 30 × 45 Á). Trojrozměrná konformace polypeptidového řetězce je udržována 4 disulfidovými (- S - S -) vazbami. (V lysozymu lidského mléka jsou 3, v bílku husích vajec 2 a v lysozymu fágu T4 nejsou žádné; čím více disulfidových skupin, tím je lysozym stabilnější, ale tím méně aktivní.) Lysozymová globule skládá se ze dvou částí oddělených mezerou; v jedné části většina aminokyselin (leucin, isoleucin, tryptofan atd.) obsahuje hydrofobní skupiny, v ostatních převažují aminokyseliny (lysin, arginin, kyselina asparagová aj.) s polárními skupinami. Polarita prostředí ovlivňuje ionizaci dvou karboxylových skupin (- COOH) umístěných na povrchu mezery molekuly na různých stranách (viz obrázek). Lysozym působí na jednu z hlavních složek bakteriální stěny – komplexní polysacharid sestávající ze dvou typů aminocukrů. Polysacharid je sorbován na molekulu lysozymu v mezeře na rozhraní jeho hydrofobní a hydrofilní části tak, že se na enzym naváže 6 kruhů aminocukrů a jedna z glykosidických vazeb je spojuje (mezi 4 a 5 kruhy) je mezi karboxyly. Vlivem interakcí mezi karboxyly lysozymu a atomy tvořícími glykosidickou vazbu a také zkreslením vazebných úhlů substrátu dochází k aktivaci a štěpení vazby. To vede k destrukci bakteriální buněčné membrány.
Rýže. Struktura lysozymu. (N. A. Kravčenko)
Zbytky kyseliny glutamové (Glu35) a kyseliny asparagové (Asp52) jsou kritické pro funkci enzymu. Glu35 působí jako donor protonů, když je narušena glykosidická vazba substrátu, čímž se vazba ničí, a Asp52 působí jako nukleofil při tvorbě meziproduktu – glykosylového enzymu. Glykosylový enzym poté reaguje s molekulou vody, což způsobí, že se enzym vrátí do původního stavu a vytvoří produkt hydrolýzy.
Droga lysozym se používá při léčbě očí, nosohltanu, dásní, popálenin, v porodnictví aj. V potravinářském průmyslu je registrován jako potravinářská přídatná látka E1105.
Na příkladu léčiva lysoamidázy a lysozymu jsou demonstrovány vyhlídky využití bakteriolytických enzymů jako účinného terapeutického prostředku pro boj proti patogenním bakteriím, včetně těch, které jsou násobně rezistentní na antibiotika.
Navzdory velkému zájmu o problém enzymatické lýzy mikroorganismů neexistuje v Rusku průmyslová výroba přípravků lytických enzymů. Proto je studium podmínek biosyntézy lytických enzymů a vývoj technologie pro získání přípravku lytického enzymu pro použití v různých odvětvích národního hospodářství a lékařství relevantní a perspektivní.
2. Savelyev E.P., Petrov G.I. Molekulární základy struktury bakteriální buněčné stěny // Pokroky v biologické chemii. 1978. T. 19. S. 106.
3. Zakharova I.Ya., Pavlova I.N. Lytické enzymy mikroorganismů. Kyjev: Nauk. Dumka, 1985.
4. Skrjabin G.K., Kulajev I.S. Lysoamidáza - výzva pro mikroby // Věda v SSSR. 1990. č. 2. S. 52-53.
5. Kulajev I.S. Bakteriolytické enzymy mikrobiálního původu v biologii a medicíně. // SOZH, 1997, č. 3, s. 23–31.
6. Phillips D., Trojrozměrná struktura molekuly enzymu, ve sbírce: Molecules and Cells, trans. z angličtiny, V. 3, M., 1968;
7. Wikipedie: bezplatná encyklopedie [Elektronický zdroj]. – URL: http://ru.wikipedia.org/wiki/Lysozyme (datum přístupu: 15.05.2010)
8. Akademici: elektronické encyklopedie [Elektronický zdroj]. – URL: http://dic.academic.ru/dic.nsf/bse/103560/lysozyme (datum přístupu: 15.05.2010)
